正交實驗優(yōu)選常春油麻藤總黃酮提取工藝的研究

1、正交實驗優(yōu)選常春油麻藤總黃酮提取工藝的研究                             作者：張凌 劉亞麗 饒志軍 馮軍【摘要】  目的研究提取常春油麻藤中總黃酮的最佳工藝條件。方法以蘆丁為指標(biāo)，用NaNO2- Al(NO3)3-NaOH顯色體系作為顯色劑，用正交實驗法對常春油麻藤總黃酮提取方法進(jìn)

2、行了系統(tǒng)研究。結(jié)果最佳提取工藝為30倍量60%乙醇回流3次，40 min/次，常春油麻藤中總黃酮的含量為12.43%。結(jié)論乙醇濃度、料液比、回流時間和提取次數(shù)對常春油麻藤總黃酮的提取均有影響。最佳提取工藝為A2B3D1C1。 【關(guān)鍵詞】  常春油麻藤 總黃酮 蘆丁 紫外分光光度法 正交實驗AbstractObjectiveTo study the optimum extraction technology of total flavonoids in Mucuna sempervirens Hemsl. MethodsUsing Rutin as the evaluating cri

3、teria and NaNO2- Al(NO3)3-NaOH as chromogenic agent, the extraction condition was studied by orthogonal test. ResultsThe optimum extraction technology was as follows：solid-liquid ratio 1：30, 60% ethanol, refluxing and extracting for 40 min, 3 times. The total flavonoids in Mucuna sempervirens Hemsl

4、was 12.43%. ConclusionEthanol concentration, solid-liquid ratio, extraction time and number of times have significant impact on extraction of total flavonoids in Mucuna sempervirens Hemsl. The optimum extraction technology is A2B3D1C1.Key wordsMucuna sempervirens Hemsl.;  Total flavonoids; 

5、;  Rutin;   UV;   Orthogonal design    常春油麻藤，是豐城雞血藤的一個品種，又名牛馬藤或大血藤，是豆科植物常春油麻藤 Mucuna sempervirens Hemsl. 的藤莖。性溫，味苦。具有行血活血、通經(jīng)活絡(luò)之功效，主治關(guān)節(jié)風(fēng)濕痛、跌打損傷、血虛、月經(jīng)不調(diào)及經(jīng)閉。有文獻(xiàn)報道，常春油麻藤中主要含有黃酮類成分，如刺芒柄花素、大豆黃素以及3,7-二羥基-6-甲氧基二氫黃酮等1。黃酮化合物具有降血糖、降血脂、抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、消除體內(nèi)自由基等藥理作用。基于黃酮類化合物是其

6、有效成分之一。因此，研究其定量方法，不僅對了解其中黃酮成分含量以觀察藥物的療效與成分間關(guān)系具有一定意義，而且對控制生藥質(zhì)量，進(jìn)一步制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。本文以提取物中總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交實驗設(shè)計和紫外分光光度法對常春油麻藤中總黃酮的提取條件及含量測定進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用常春油麻藤及雞血藤資源提供科學(xué)依據(jù)。1  器材1.1  儀器U-3000 Spectrophotometer(日本島津公司)；電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB3200超聲波清洗儀（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)

7、療設(shè)備廠）；X-9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。1.2  材料與試劑蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：100080-200306）；常春油麻藤藥材（采自于江西省南昌市灣里區(qū)梅嶺山脈，由江西中醫(yī)學(xué)院中藥系賴學(xué)文老師采集并鑒定）；所用試劑均為分析純。2  方法與結(jié)果2.1  總黃酮的測定方法2.1.1  測定方法依據(jù)在黃酮類化合物的紫外光譜圖上主要有兩個吸收帶：環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶（300550 nm）和環(huán)苯酰系統(tǒng)引起的吸

8、收帶（240280 nm）。若加入鋁鹽，則鋁離子與黃酮化合物形成穩(wěn)定的配合物，帶會明顯向長波方向移動（紅移）；在NaNO2的強堿性溶液中，其在500510 nm處吸光度值最大，從而為分光光度法測定提供了可靠的依據(jù)。2.1.2   測定方法取4個10 ml容量瓶，1，2號分別加入1 ml蘆丁對照品溶液和1 ml稀釋到一定倍數(shù)的常春油麻藤溶液，各加60%的乙醇稀釋至刻度，以60%乙醇為空白，在紫外分光光度計上于200760 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。3，4號分別加入1 ml蘆丁對照品溶液和1 ml稀釋到與2號同樣倍數(shù)的常春油麻藤溶液，加入0.15 ml 5% NaNO2溶液搖勻，

9、放置6 min；加入0.15ml 10% Al(NO3)3溶液搖勻，放置6 min；加入4 ml 1 mol/L NaOH溶液搖勻，定容，放置015 min，用同樣方法加入顯色劑的溶劑作空白，在200760 nm波長范圍內(nèi)掃描2，得出吸收光譜，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，在未加顯色劑以前，對照品在361 nm和257 nm處有最大吸收，供試品在282 nm處有最大吸收，加入NaNO2- Al(NO3)3-NaOH顯色體系后，對照品和供試品的吸收峰都發(fā)生了紅移，在502 nm處有最大吸收。因此，可以確定502 nm為測定波長。2.1.3  對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品19.84

10、mg，置于50 ml容量瓶中，加60%乙醇溶解（如不溶，置水浴上微熱并短時超聲使之溶解），用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液（每毫升含蘆丁0.992 mg）。2.1.4  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取蘆丁對照品溶液0，0.2，0.5，1，1.2，1.5ml，分別置于10 ml容量瓶中，加60%乙醇至2 ml，然后按照“2.1.2”項中“加入0.5 ml 5%NaNO2 溶液”起，至“放置015 min”操作，以第一瓶溶液作空白，在502 nm測定各溶液的吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程：C=78.93A+0.201，相關(guān)系數(shù)：r=0.999 7。數(shù)據(jù)見表1，

11、標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。表1  標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)（略）2.1.5   供試品溶液的制備取常春油麻藤粉末約0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流至提取液無色，棄去乙醚提取液。待乙醚揮干后，將粉末置干燥箱中60干燥約1 h,然后全部轉(zhuǎn)移至150 ml燒瓶中，并按正交實驗設(shè)計表中的因素和水平，精密加入規(guī)定濃度的乙醇，回流提取，濾過，合并濾液，置水浴上揮干，并轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得。精密量取各份溶液2 ml，稀釋到10 ml容量瓶，從稀釋液中量取1 ml至10 ml容量瓶，按照“2.1.2”項中“加入0.5ml 5%NaN

12、O2 溶液”起，至“放置015 min”操作，用以同樣方法加入顯色劑的溶劑作空白，測定吸收度，由回歸方程換算成總黃酮濃度。2.1.6  穩(wěn)定性實驗精密吸取對照品溶液和稀釋5倍后的供試品溶液各1 ml，分別按照“2.1.2”中“加入0.15 ml 5%NaNO2 溶液”起，至“加入4 ml 1 mol/L NaOH溶液搖勻，定容”操作，用以同樣方法加入顯色劑的溶劑作空白，分別在2，5，15，30，45，60 min測定吸收度，結(jié)果表明，對照品吸收度RSD0.41%(n=6)，樣品吸收度RSD=1.09%,說明穩(wěn)定性良好。數(shù)據(jù)見表2。表2  穩(wěn)定性實驗（略）2.1.7 

13、; 精密度實驗精密吸取同一份對照品和稀釋5倍后的供試品溶液各5份，每份1 ml，按照“2.1.2”中“加入0.5 ml 5%NaNO2 溶液”起，至“放置015 min”操作，用以同樣方法加入顯色劑的溶劑作空白，測定吸收度，結(jié)果表明，對照品吸收度RSD0.66%（n5），樣品吸收度RSD0.83%(n=5)，說明精密度良好。數(shù)據(jù)見表3。2.1.8  重復(fù)性實驗取同一份常春油麻藤樣品細(xì)粉5份，然后按照“供試品溶液的制備”項下操作，測定樣品加入顯色劑15 min內(nèi)在502 nm波長下的吸收度，結(jié)果表明，5次測定的平均含量為12.22%，RSD1.15%，說明重復(fù)性良好。數(shù)據(jù)見表4。表3&

14、#160; 精密度實驗（略）表4  重復(fù)性實驗（略）百事通2.1.9  加樣回收率實驗取已知總黃酮含量的常春油麻藤細(xì)粉（含總黃酮12.29%）5份，每份約0.25 g，精密稱定，加入蘆丁對照品一定量，然后照“供試品溶液的制備”項下進(jìn)行制備并測定，計算回收率，結(jié)果表明，5次測定的平均回收率為97.64%，RSD=1.92%(n=5)。說明該測定方法測得的結(jié)果準(zhǔn)確。數(shù)據(jù)見表5。表5  加樣回收率實驗（略）2.2  用正交實驗優(yōu)選總黃酮的提取條件2.2.1  實驗安排選擇乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)4個因素，每個因素選擇3個水平，編制L9（3

15、4）因素水平表3，4，見表6。將對應(yīng)的各因素和水平填入表7，按表7安排的條件進(jìn)行實驗。表6  L9（34）因素水平（略）2.2.2  結(jié)果分析實驗結(jié)果見表7。用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。表7  L9（34）正交實驗設(shè)計（略）表8  總黃酮含量分析（略）Corrected Model 統(tǒng)計量F8 109.128，P=0.000<0.05,所選模型有統(tǒng)計學(xué)意義，其中A，B，C，D均是P0.000<0.05，說明它們對實驗結(jié)果均有顯著性影響，其因素的主次順序為：ABDC。再由各因素的均數(shù)判斷其最佳水平，其中A應(yīng)選2水平，B選3水平

16、，D選1水平，C選1水平，所以最佳實驗方案是A2B3D1C1，即30倍量60%乙醇回流3次。40 min/次。在此工藝條件下，我們進(jìn)行了驗證實驗，結(jié)果總黃酮的得率達(dá)到12.43%。結(jié)果見表9。表9  驗證實驗數(shù)據(jù)（略）3  討論3.1  對照品的選擇本實驗選用蘆丁作為對照品，因為蘆丁是黃酮化合物中比較有代表性的一種，其B環(huán)的3，4，-鄰二酚羥基部位發(fā)生紫外吸收，可以通過測定蘆丁對照品的吸收度，從而求算供試品中總黃酮的含量。這是總黃酮含量測定實驗中比較經(jīng)典的方法。我們曾經(jīng)嘗試過用常春油麻藤中所含主要成分刺芒柄花素和大豆黃素作為總黃酮含量測定時的對照品，但是不論是否加

17、顯色劑，都不能使對照品和供試品在同一波長處有最大吸收。最終我們確定了以蘆丁為對照品測定供試品中總黃酮的含量。3.2  顯色劑和顯色方法的選擇3.2.1   顯色劑的選擇我們曾經(jīng)嘗試過不加顯色劑，結(jié)果對照品在361 nm和257 nm處有最大吸收，而供試品在282nm處有最大吸收，因此我們考慮加入顯色劑。我們嘗試過AlCl3、Al(NO3)3、NaNO2- Al(NO3)3-NaOH顯色體系，最終用NaNO2- Al(NO3)3-NaOH顯色體系后，對照品和供試品在502  nm處都有最大吸收，故選擇NaNO2- Al(NO3)3-NaOH顯色體系作為顯色

18、劑。3.2.2  顯色時間的確定有文獻(xiàn)報道35，使用NaNO2- Al(NO3)3-NaOH顯色體系時，步驟為加入0.3 ml 5% NaNO2溶液搖勻，放置6 min，加入0.3 ml 10% Al(NO3)3溶液搖勻,放置6 min，再加入4 ml 1 mol/L的NaOH溶液搖勻，放置15 min。但是，實驗證實 NaNO2、Al(NO3)3、NaOH三者的體積比為0.30.38，且放置時間盡量控制在15 min以內(nèi)顯色效果更好，尤其是供試品，由于其中黃酮成分不只一種，化學(xué)性質(zhì)相對于蘆丁對照品不穩(wěn)定，所以在加入顯色劑后應(yīng)盡快測定。 3.3   關(guān)于供試品脫脂  我們用乙醚對常春油麻藤粉末進(jìn)行脫脂預(yù)處理，然后提取，并與不進(jìn)行預(yù)處理直接提取所得溶液的總黃酮含量相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用乙醚脫脂的供試品溶液的總黃酮含量比未進(jìn)行脫脂處理的供試品含量高。所以我們最后確定用乙醚對常春油麻藤粉末進(jìn)行脫脂處理。見表10。表10  脫脂處理