殘留除草劑的檢測(cè)

1、 殘留除草劑的檢測(cè)報(bào)告人：蘇曉卉聚乙烯醇苯乙烯吡啶聚合固定葉綠體膜的制備并用于殘留除草劑檢測(cè) !實(shí)驗(yàn)原理 在非光照條件下 ，葉綠體具有降解雙氧水的抗脅迫能力，即葉綠體束縛酶能催化雙氧水分解產(chǎn)生O2，而絕大多數(shù)除草劑對(duì)該反應(yīng)有較強(qiáng)的抵抗作用。!反應(yīng)方程式2H2O2葉綠體束縛酶2H2O O2!特點(diǎn) 研究了 PVA-SbQ 光聚合物固定化葉綠體膜的性質(zhì)，結(jié)果證明該法固定的葉綠體束縛酶具有活性高、壽命長(zhǎng)和使用方便等特點(diǎn)。聚乙烯醇苯乙烯吡啶聚合固定葉綠體膜的制備并用于殘留除草劑檢測(cè) 將葉綠體處理后用聚乙烯醇-苯乙烯吡啶 ( PVA -SbQ)聚合膜進(jìn)行固定 ，得到固定化的葉綠體膜，該膜中葉綠體束縛酶能催

2、化H2O2的分解產(chǎn)生氧 ，而除草劑對(duì)該指示反應(yīng)有抑制作用。利用氧電極 ，建立了新的用于檢測(cè)痕量除草劑的電流分析法。4檢測(cè)痕量除草劑的電流分析法4檢測(cè)范圍 所檢測(cè)的除草劑有阿特拉津、莠滅凈、草凈津、西瑪三嗪、撲草凈、敵草隆和百草枯等，檢測(cè)濃度范圍分別為0.251.75，0.040.70，0.101.10，0.100.80，0.201.80，0.010.12和0.0060.02mg/L。實(shí)驗(yàn)部分 &葉綠體的提取和固定&實(shí)驗(yàn)儀器氧分析儀及氧電極組織搗碎機(jī)高速冷凍離心機(jī) BH2型相差顯微鏡超級(jí)恒溫槽 H-600型透射電子顯微鏡 CliniBio-128oC酶標(biāo)儀 UTL1386-3V型低溫冰箱 將新鮮

3、菠菜葉片破碎，分離出葉綠體，測(cè)定其中葉綠素的含量。再利用PVA-SbQ 光聚合技術(shù)將葉綠體固定。 實(shí)驗(yàn)部分 z實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)材料 PVA-SbQ規(guī)格如下：SbQ濃度為1.34102mol/L，固態(tài)物含量10.04（質(zhì)量分?jǐn)?shù)w），聚合度3500，皂化度 88；2 ，6二氯酚靛藍(lán)（DPIP ），使用前用水配制成3104mol/L；除草劑由原料用 2 乙醇溶液配制，并用該乙醇溶液逐級(jí)稀釋成工作液。其濃度分別為百草枯、敵草隆各1 mg/L；阿特拉津、撲草凈和莠滅津各5mg/L 等。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水；菠菜種子為香港的“超級(jí)菠菜”，土壤培養(yǎng)8星期，株均重25 g，晴朗天

4、氣上午 9時(shí)取葉。實(shí)驗(yàn)方法 氧電極的內(nèi)充液為0.5mol/L KCl溶液。首先用空氣飽和Na2CO3的蒸餾水和飽和溶液對(duì)氧測(cè)定儀進(jìn)行滿刻度調(diào)節(jié)和調(diào)零，然后取一片 4mm2 葉綠體固定化膜（或相同葉綠素濃度的葉綠體懸浮液）放入內(nèi)體積為2mL的反應(yīng)池中，加入pH7.4的Tris-HCl 510-3mol/L MgCl2緩沖溶液1.5mL，0.08mol/L H2O2100L，加水至2mL。插入氧電極，反應(yīng)池外層通28oC恒溫循環(huán)水，攪拌反應(yīng)液3min，從記錄儀上讀取放氧量P0。更換反應(yīng)池中的溶液和固定化膜，用微量進(jìn)樣器加入一定量的除草劑，測(cè)量P，計(jì)算 P= P0- P。每次測(cè)量都使用新的葉綠體固定

5、膜。測(cè)定裝置如圖1。 機(jī)理討論 與除草劑對(duì)葉綠體光合作用 Hill 反應(yīng)的抑制作用的機(jī)理不同，實(shí)驗(yàn)中除草劑對(duì)葉綠體抗脅迫的抑制作用主要涉及到如下的酶反應(yīng)：在抗壞血酸過(guò)氧化酶（AA-POD）的催化作用下，H2O2被抗壞血酸（A A）氧化生成單脫氫抗壞血酸（MDA）。 MDA可通過(guò)歧化作用生成AA和脫氫抗壞血酸（DHA）。而DHA在脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的催化作用下，與還原性谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成 AA，GSH 被氧化為氧化型谷胱苷肽（GSSG）。GSSG則在 GR 的作用下利用葉綠體中大量存在的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADPH ）作為電子供體重新生成GSH。除草劑在避光條件下的

6、抑制作用主要是通過(guò)與AA-POD和GR等相關(guān)酶結(jié)合來(lái)抑制這些酶的活性。影響因素 葉綠體膜的活性 根據(jù)測(cè)得的PVA-SbQ固定化葉綠體膜催化降解過(guò)氧化氫產(chǎn)生氧氣的速率來(lái)計(jì)算膜的活性。本實(shí)驗(yàn)采用敵草隆作為樣品（以下實(shí)驗(yàn)除指明外，均采用敵草隆），結(jié)果如圖2。由圖2可見(jiàn)，保存在-20oC冰箱中的PVA-SbQ固定膜1個(gè)月內(nèi)活性基本沒(méi)有改變；5個(gè)月后，膜活性保留仍超過(guò)50，滿足實(shí)際測(cè)定要求。 影響因素葉綠體膜的活性溶液pH值的影響 葉綠體中酶抗脅迫能力在中性和弱堿性溶液中表現(xiàn)最強(qiáng)磷酸鹽緩沖液硼酸鹽緩沖液Tris-HCl緩沖液碳酸氫鹽緩沖液溶液pH為7.4時(shí)，除草劑的抑制作用最明顯，放氧量差值達(dá)最大本實(shí)驗(yàn)

7、選擇pH為7.4確定采用 Tris- HCl緩沖液溫度的影響 溫度對(duì)葉綠體束縛酶對(duì)H2O2的抗脅迫作用和除草劑對(duì)該指示反應(yīng)的抑制作用都有影響，故對(duì)測(cè)定結(jié)果也有影響。實(shí)驗(yàn)表明：在5 27oC，隨溫度升高空白溶液和含除草劑體系溶液的放氧量都增大，且P也隨著增大。但溫度高于27oC時(shí)，由于空白溶液的放氧量增加過(guò)快，P反而逐漸減小。故選擇測(cè)定溫度為27oC。 過(guò)氧化氫加入量的確定 H2O2降解酶的量由PVA-SbQ固定膜中葉綠體的數(shù)量決定 ，對(duì)于厚度固定的葉綠體膜 ，則由膜面積的大小決定 。膜的面積增加，葉綠體濃度增大 ，產(chǎn)生的氧濃度大 ，除草劑抑制酶反應(yīng)引起的 P也增大，但膜片面積達(dá)到6mm2 時(shí)，

8、P反而減小。另外，體系的空白值過(guò)大時(shí) ，由于產(chǎn)生的氧濃度太大 ，易超出儀器量程而使測(cè)定范圍變窄。故本實(shí)驗(yàn)?zāi)て娣e選擇4mm2。膜片面積對(duì)測(cè)定的影響 利用葉綠體束縛酶在無(wú)光照的條件下對(duì) H2 O2 分解產(chǎn)生氧的反應(yīng)作為測(cè)定除草劑的指示反應(yīng) ，因此 ，H2 O2 的加入量對(duì)測(cè)定有較大影響 。當(dāng) H2O2 的量小于 2.410-4 mol/L 時(shí)，反應(yīng)的放氧量小，而使P很小，測(cè)定的靈敏度較低 ；當(dāng) H2O2的量大于6.0 10-4 mol/L 時(shí)，反應(yīng)杯中的氧氣產(chǎn)生量太大而使空白值增大，結(jié)果導(dǎo)致測(cè)定的檢測(cè)范圍很窄。綜合考慮各種因素 ，確定 H2 O2 的濃度為4.010-4mol/L。校準(zhǔn)曲線 按照

9、實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定了不同濃度范圍的阿特拉津、莠滅凈、草凈津、西瑪三嗪、撲草凈、敵草隆及百草枯的校準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1。由表1可見(jiàn)，百草枯測(cè)定的濃度最低。 固化與未固化葉綠體活性的差異 取含有相同濃度葉綠素的懸浮液和固化膜，分別測(cè)出未加除草劑的放氧量P0，計(jì)算 （P0- Pi）/ P0，結(jié)果如表 2 ?？梢?jiàn)，利用PVA-SbQ固定葉綠體膜比用葉綠體懸浮液檢測(cè)的氧減少率高。即PVA-SbQ固定葉綠體膜的活性高 ，用于除草劑的檢測(cè)靈敏度高于葉綠體懸浮液。 不同固定方法對(duì)葉綠體膜活性的影響 取冷藏于-20oC冰箱中的含有相同濃度葉綠素的PVA-SbQ固化膜、戊二醛 牛血清蛋白固定葉綠體膜以及海藻酸鈣固定葉

10、綠體膜，按照上述實(shí)驗(yàn)方法 ，分別測(cè)定它們?cè)诜胖貌煌瑫r(shí)間時(shí)對(duì)H2O2 響應(yīng)的校正曲線，計(jì)算曲線的斜率，結(jié)果如表3 。 可見(jiàn)，PVA-SbQ 固定葉綠體膜在不同時(shí)間下都具有比其 它兩種固定化方法更高的活性。 G樣品分析G 各取 500 mL 農(nóng)田水樣于聚四氟乙烯瓶中 ，試液經(jīng)過(guò)濾后，加入 10 mL 5 EDTA溶液。先直接按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，未檢出其中除草劑的量；再分別加入敵草隆標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度分別為0.02 mol/L，0.05 mol/L，測(cè)得加標(biāo)回收率為 89.2 98.7。另取室內(nèi)盆載土壤，噴灑一定量阿特拉津的溶液，混勻后分別稱取25g樣品于 250 mL錐形瓶中。用本法測(cè)定，結(jié)果為 0.48g/L（n=3）；另取部分該土壤樣品 ，用固相萃取HCLP 法進(jìn)行測(cè)定 ，結(jié)果為0.51g/L。兩結(jié)果基本吻合。 F重現(xiàn)性F 每次測(cè)定時(shí)更換葉綠體膜片，分別對(duì)0.05mg/L敵草隆進(jìn)行測(cè)定（n11），得RSD 5.4。重現(xiàn)性與溶液、溫度等測(cè)定條件有關(guān)，為保證測(cè)量的精確度，還應(yīng)使用大小相同的PVA-SbQ膜