高效液相色譜法測(cè)定沙棘提取物中總黃酮含量

1、藥品質(zhì)量與檢驗(yàn)高效液相色譜法測(cè)定沙棘提取物中總黃酮含量張榮泉張蓉(天津醫(yī)藥科學(xué)研究所天津300070摘要目的:應(yīng)用反相高效液相色譜法測(cè)定沙棘提取物中總黃酮含量。方法:用外標(biāo)法, 以Shim -pack O DS 為固定相, 甲醇0. 4%磷酸(6050 為流動(dòng)相, 檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm, 流速為1. 0ml/min 。結(jié)果:槲皮素含量測(cè)定的線性范圍為0. 6163. 080 g (r =0. 9996, n =5 , 平均回收率為99. 26%, RSD =0. 80%(n =5 。結(jié)論:本法操作簡(jiǎn)便, 快速、準(zhǔn)確。關(guān)鍵詞沙棘提取物總黃酮高效液相色譜法中圖分類號(hào):R927. 2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

2、文章編號(hào):1006-5687(2001 03-0065-02沙棘為胡頹子科沙棘屬H ipp op hae L 的植物。文獻(xiàn)報(bào)道1, 沙棘果、葉及全株均含有豐富的黃酮類化合物, 而葉中的黃酮含量明顯高于果實(shí)。已被鑒定的有槲皮素、異鼠李素、山萘酚及其甙類、蘆丁等。它們的藥理作用逐漸為醫(yī)藥界所認(rèn)識(shí)。目前, 沙棘總黃酮的含量測(cè)定方法不一, 但多是測(cè)定游離的異鼠李素、槲皮素或僅測(cè)定蘆丁和游離的異鼠李素、槲皮素作為總黃酮含量2, 我們分析比較了大量的水解和未水解樣品的硅膠G 薄層色譜和液相色譜圖, 發(fā)現(xiàn)水解后樣品中幾種甙元含量均明顯增加。因此, 我們采用了兩步試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定, 其結(jié)果準(zhǔn)確度高, 重現(xiàn)性好

3、, 可操作性強(qiáng)。1儀器與試藥島津10A 高效液相色譜儀, 紫外檢測(cè)器SPD 10A vp, 柱溫箱CT O 10A vp, 積分儀C R 8A ; A E 240電子分析天平(瑞士梅特勒 ; 槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供 。沙棘提取物樣品、樣品(南開(kāi)大學(xué)提供 ; 甲醇為色譜純, 其余試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2. 1色譜條件色譜柱:島津Shim -pack vp -O DS 5 m 250L (mm ×4. 6(i, d ; 流動(dòng)相:甲醇0. 4%磷酸(6050 ; 流速1. 0ml/min; 檢測(cè)波長(zhǎng)370nm; 柱溫30; 定量方法為外標(biāo)法。在此實(shí)驗(yàn)條件下, 槲皮素

4、、異鼠李素、山奈酚得到較好分離, 理論板數(shù)按槲皮素計(jì)算為2696, 測(cè)得的對(duì)照品與樣品色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。2. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取槲皮素對(duì)照品約3mg 于50m l 量瓶中, 用甲醇溶解并稀釋至刻度。分別精密吸取1、2、3、4、5ml 置10ml 量瓶中, 加甲醇稀釋至刻度, 搖勻。精密吸取10 l 進(jìn)樣, 以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo), 峰面積為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明, 當(dāng)槲皮素進(jìn)標(biāo)量在0. 06160. 3080 g 范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系(見(jiàn)表1 , 回歸方程為Y =4. 505×10-6X +0. 140, r =0. 9996。2. 3樣品制備沙棘提取物, 經(jīng)硅

5、膠G 薄層色譜分析(以氯仿甲醇甲酸=910. 5為展開(kāi)劑, 10%硫酸乙醇液為顯色劑 , 樣品中有部分甙類和甙元色譜斑點(diǎn), 樣品中只有甙類斑點(diǎn), 而看不出有甙元顯色。因此, 對(duì)兩樣品采用不同 的制備方法。圖1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖a. 槲皮素b. 山萘酚c. 異鼠李素圖2水解樣品色譜圖表1進(jìn)樣量與峰面積關(guān)系進(jìn)樣量( g 0. 06160. 12320. 18480. 24640. 3080峰面積111703239896370124519183655276精稱沙棘提取物樣品兩份(A 、B 各約50mg , 樣品(A 加100ml 甲醇, 精稱重量, 于水浴回流提取4小時(shí), 冷卻, 補(bǔ)足甲醇量, 吸取

6、上清液, 過(guò)0. 45 m 濾膜, 得樣(A 供試液。樣品(B 置250ml 圓底燒瓶中, 加甲醇20ml, 25%鹽酸5ml , 水浴回流提取45分鐘, 趁熱過(guò)濾, 用甲醇稀釋定容至50ml, 精密吸取1ml, 于5ml 量瓶中, 用甲醇稀釋定容至刻度, 搖勻, 即得樣(B 供試液。65天津藥學(xué)2001年6月第13卷第3期, , ,精稱沙棘提取物樣品約50m g , 按樣(B 的制備方法, 稀釋定容至50ml, 得樣品供試液。2. 4精密度與重現(xiàn)性取同一批樣品(以樣為例 , 精密吸取樣(B 5 l, 注入色譜儀, 連續(xù)進(jìn)樣5次, 以水解后槲皮素峰面積為指標(biāo), 觀察精密度, 結(jié)果見(jiàn)表2。同一批

7、樣品(以樣為例 , 稱取5份樣品, 精密吸取樣(A 10 l , 樣(B 5 l , 注入色譜儀, 測(cè)定峰面積觀察重現(xiàn)性, 計(jì)算含量分別為22. 48%、23. 57%、23. 59%、24. 76%、22. 83%, x -=23. 52%, RS D =3. 8%。2. 5穩(wěn)定性取同一批樣品(以樣為例 , 精密吸取樣(B 5 l , , 注入色譜儀, 每隔一定時(shí)間進(jìn)樣一次, 測(cè)定峰面積, 結(jié)果見(jiàn)表3。表2樣品進(jìn)樣精密度峰面積值12345平均值RS D (% 槲皮素3684953649203638833674063637483656900. 58山萘酚18657518439118746318

8、58241852861859080. 63異鼠李素5873915869055846275839935861485857290. 282. 6回收率測(cè)定以槲皮素為測(cè)定指標(biāo), 分別精密稱取樣品50mg , 加槲皮素對(duì)照品約2mg , 加甲醇20ml, 25%鹽酸5ml , 水浴回流提取45分鐘, 加甲醇稀釋定容至50ml , 精密吸取1ml 于5ml 量瓶中, 用甲醇稀釋定容至刻度, 搖勻。進(jìn)樣15 l 測(cè)定, 并計(jì)算回收率, 結(jié)果見(jiàn)表4。表3不同時(shí)間測(cè)得峰面積時(shí)間(h0. 51. 02. 04. 08. 012. 0x -R S D (% 槲皮素峰面積3663523673483628723641

9、953682943635233654310. 61山萘酚峰面積1863581850161859431871271835241841681853560. 74異鼠李素峰面積5876325842535853095881945864275891355868250. 32表4樣品回收率樣品量(mg 樣品中含槲皮素量(mg 加入量(mg 測(cè)定值(m g 回收值(mg 回收率(% 50. 181. 9372. 013. 9402. 00599. 850. 311. 9422. 003. 9301. 99899. 450. 671. 9562. 033. 9582. 00198. 650. 361. 944

10、2. 023. 9682. 024100. 250. 241. 9392. 003. 9051. 96698. 3x -=99. 26%, R SD =0. 80%2. 7樣品測(cè)定將樣品制備項(xiàng)下樣(A 10 l 、樣(B 5 l 、樣15 l, 注入色譜儀測(cè)定游離甙元含量、甙類含量、總黃酮含量, 結(jié)果見(jiàn)表5。表5沙棘提取物中總黃酮含量(%游離甙元含量甙類含量總黃酮含量樣(A 、B 3. 8619. 9623. 82樣/8. 808. 803討論3. 1本方法用槲皮素對(duì)照品測(cè)定水解后樣品中的總甙元量, 減去未水解樣品中游離甙元的量, 再乘以系數(shù)2. 51, 得沙棘葉中甙的含量, 加上測(cè)定出的游離

11、甙元的量為沙棘葉中總黃酮含量。3. 2水解后樣品中異鼠李素含量較高, 若分別用槲皮素、異鼠李素和山萘酚3個(gè)指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行對(duì)照品測(cè)定, 結(jié)果會(huì)更合理, 但由于異鼠李素對(duì)照品無(wú)法購(gòu)到, 故本文僅以槲皮素?fù)Q算出含量。3. 3通過(guò)本實(shí)驗(yàn)提示, 不同部位的沙棘提取物(樣、樣 其黃酮含量可有很大差別。參考文獻(xiàn)1吳素林. 反相HPLC 法同時(shí)測(cè)定沙棘果肉異鼠李素、槲皮素及沙棘總黃酮的含量. 沙棘, 1998, 11(4 :312付桂香. 高效液相色譜法測(cè)定沙棘葉中黃酮含量. 中國(guó)中藥雜志, 1997, 22(5 :299(收稿日期:2001-03-07Determination of Total Flavon

12、e in Fruit of Seabuckthorn Extracts by HPLCZhang Rongquan, Zhang Rong(T ianjin In stitute of M edical and Ph ar-m aceutical Science , T ianjin 300070ABSTRACT Objective:To determ ine th e conten t of total flavone in Fru it of Seabuck th or n extracts b y using a revers e HPLC m ethod . M ethods :A e

13、xternal stan dard m ethod w ith Shim-pack ODS as fix ed phas e an d methanol-0. 4%phosph or ic acid (60:50 as mobile ph as e was us ed, Th e w aveleng th for detection w as 370nm an d the flow rate was 1. 0ml/min. Res ults:T he lin ear range for th e determ ination of qu ercetine w ere 0. 06160. 3080 g (r =0. 9996, n =5 . Th e aver-age reco