芥菜中總黃酮的提取及其對羥自由基的清除作用研究

1、芥菜中總黃酮的提取及其對羥自由基的清除作用研究【摘要】目的探討芥菜中總黃酮的提取、鑒別方法及對羥自由基清除作用，以充分利用芥菜植物資源，避免資源的浪費(fèi)。方法采用超聲波乙醇浸提法從芥菜中提取黃酮類物質(zhì)，對所提取的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，并用分光光度法測定含量，用芥菜總黃酮對羥自由基清除作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果測得樣品中總黃酮的含量C=0.4450 mg/ml，回收率為100.7%，其純度和產(chǎn)率均較高。結(jié)論該方法采用全物理過程，無任何污染，是提取芥菜中黃酮類物質(zhì)的有效途徑。芥菜總黃酮提取液對Fenton體系產(chǎn)生的OH自由基有很好的清除作用。 【關(guān)鍵詞】 超聲波提取 芥菜 總黃酮 鑒別 自由基 清除Extra

2、ction of Total Flavone from Bragica juncea Coss and Its Effects on Scavenging of Hydroxyl RadicalsHUANG Suoyi, LI Haini, TANG YulianDepartment of Chemistry, Youjiang Medical College for Nationalities，Baise, Guangxi 533000，ChinaAbstract：ObjectiveTo make use of the resources of Bragica juncea coss， av

3、oid wasting and approach the extraction of total flavanone of Bragica juncea Coss and its effects on scavenging of hydroxyl radicals. MethodsThe flavonoids were extracted by ethanol as the solvent from Bragica juncea coss with ultrasonic wave and ethanol extraction .Using spectrophotometry to extrac

4、t and check the flavone of Bragica juncea Coss.Results The effect of extracts of Bragica juncea Coss scavenging of hydroxyl radicals was studiedBy this method getting the density of the total flavone of Bragica juncea Coss was C=0.4450mg/ml and the rate of recovery was 100.7%. The outcome and the pu

5、rity of the flavone were all very high . ConclusionThis method is a purely physical process and has not any pollution. It is an ideal way to extract the flavone of Bragica juncea coss. Total flavone from Bragica juncea Coss has effects on scavenging on hydroxyl radicals.Key words：Ultrasonic wave tre

6、atment； Bragica juncea Coss； Total flavone； Identification； Hydroxyl radical； Scavenging 芥菜 Bragica juncea Coss又名芥、雪里蕻、皺葉芥、黃芥，為十字花科植物芥菜 Brassia juncea（L.）Czern.et Coss油芥菜Brassia juncea（L.）Czern.et Coss.Var.gracilis Tsen et Lee的嫩莖葉。我國各地均有栽培。春季采嫩葉洗凈，民間常用之做腌菜。芥菜性味辛、溫。歸肺、胃、腎經(jīng)。具有利氣豁痰、溫中健脾、驅(qū)風(fēng)散血、消腫止痛等功效。主治

7、寒痰咳嗽、胸膈不利、胃寒少食、腹瀉、感冒風(fēng)寒及跌打損傷、關(guān)節(jié)疼痛等癥 1。目前有研究表明2：芥菜中含黃酮苷、酸性樹脂、鞣質(zhì)等，其中黃酮類等有效成分對治療冠心病、老年性癡呆、腦血栓、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和清除自由基、抑菌、抗癌等方面有顯著效果，無毒副作用，并以此開發(fā)出多種藥品和保健食品。 當(dāng)前國內(nèi)外對于芥菜中黃酮類化合物的研究還相對缺乏。目前有用乙醇抽提法提取芥菜中的黃酮類物質(zhì)的報(bào)道3，但是，該方法提取的時(shí)間較長、工藝較復(fù)雜、提取效率較低。近年來，超聲技術(shù)應(yīng)用于提取植物中的生物堿、苷類、生物活性物質(zhì)、動(dòng)物組織漿的毒質(zhì)等研究已有報(bào)道4，5，表明其具有耗能低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)。很多研究表明，利用

8、超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，可加速植物材料中的有效成分進(jìn)入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時(shí)間，并且還可避免高溫對提取成分的影響5，但超聲技術(shù)應(yīng)用于提取芥菜中黃酮類物質(zhì)的研究尚未見報(bào)道。本文報(bào)道用超聲波提取芥菜總黃酮、鑒別及提取物總黃酮對羥自由基清除作用。1 儀器與試劑1.1 儀器KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（超聲工作頻率40 kHz，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；UV-755B紫外可見分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）；ZF-I型三用紫外分析儀(上海顧村光電儀器廠)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。1.2 試劑95%乙

9、醇AR；亞硝酸鈉AR；硝酸鋁AR；氫氧化鈉AR；三氯化鋁AR；鹽酸AR；氨水AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；乙酸鎂AR；鎂粉AR；正丁醇AR；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；雙氧水AR；硫酸亞鐵AR；水楊酸AR；芥菜，采自廣西百色市。2 方法與結(jié)果2.1 總黃酮成分提取取新鮮芥菜，烘干，粉碎。稱取芥菜粉末6 g，加80 ml 95%乙醇，用超聲波提取2.5 h，抽濾。濾渣再加80 ml 95 %乙醇，用超聲波提取2.5 h，抽濾，合并濾液，減壓回收乙醇至濾液僅剩25 ml為止，放置250 ml容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，得樣品液。2.2 測定方法依據(jù)以蘆丁為對照品測定芥菜中總黃酮的

10、含量，加入鋁離子試劑，同時(shí)控制適宜pH值，使黃酮化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物，在可見光區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。2.3 定量實(shí)驗(yàn)-總黃酮的含量測定2.3.1 波長的選擇取樣品液適量，在0.30 ml 5%亞硝酸鈉溶液存在的堿性條件下，經(jīng)硝酸鋁顯色后，以試劑為空白參比液在420700 nm波長范圍測定絡(luò)合物的吸光度，絡(luò)合物于510 nm波長處有最大吸收，故測定時(shí)選用此波長。2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取蘆丁對照液（0.10 mg/ml）0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于10.00 ml容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 ml，搖勻，靜置6 mi

11、n；再加10%硝酸鋁溶液0.30 ml，搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液4.00 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，以試劑作空白參比液，于510 nm處測吸光度。結(jié)果見表1。表1 紫外可見分光光度計(jì)測定蘆丁對照液吸光度結(jié)果（略） 根據(jù)表1得回歸方程：A=-0.0221+13.7578C，r=0.9999。2.3.3 提取物含量的測定精密吸取樣品液1.00 ml，置10.00 ml容量瓶，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定吸光度,A=0.368，根據(jù)回歸方程：A=-0.022 1+13.757 8 C，r=0.999 9計(jì)算樣品中總黃酮的含量C=0.445 0 mg/ml。2

12、.3.4 回收率實(shí)驗(yàn)精密量取樣品液1.00 ml，加入標(biāo)準(zhǔn)蘆丁對照品1.00 ml（0.10 mg/ml），同前樣品測定操作方法測定吸光度，求出回收率為100.7% 。2.4 定性實(shí)驗(yàn)-總黃酮的鑒別2.4.1 顏色反應(yīng) 紫外光下呈色反應(yīng)：取該樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈灰褐色并有熒光斑點(diǎn)。 濃氨水反應(yīng)：取該樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，將濾紙?jiān)诎彼戏窖?0 s，立即在紫外光下觀察，呈極明顯的黃褐色熒光斑點(diǎn)。 三氯化鋁反應(yīng)：取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加三氯化鋁乙醇溶液，吹干。在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈黃色熒光斑點(diǎn)。 乙酸鎂反應(yīng)：取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%乙酸鎂甲醇溶液，吹

13、干，紫外光下呈黃色斑點(diǎn)。 鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取乙醇提取液1ml于試管中加鎂粉，再加入濃鹽酸數(shù)滴（1次加入），在泡沫處呈紫紅色。2.4.2 紙層析取樣品溶液10 l點(diǎn)在濾紙上。用正丁醇醋酸水=415（體積比）為展開劑，上行展開5 h，取出晾干。噴1%氯化鋁乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可見熒光斑點(diǎn)。2.5 總黃酮提取物對OH清除作用參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型6，利用H2O2與Fe2+ 混合產(chǎn)生OH，但由于OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，就能有效地捕捉OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。反應(yīng)式如下：H2O2+ Fe2+ Fe3+OH+OH- 該產(chǎn)物在510 nm處有強(qiáng)吸

14、收，若在此反應(yīng)體系中加入具有清除OH功能的被測物，便會(huì)與水楊酸競爭OH，從而使有色產(chǎn)物生成量減少，采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在相同體積的反應(yīng)體系(8.8 mmol/L H2O2 1 ml，9 mmol/L Fe2+ l ml，9 mmol/L 1 ml水楊酸-乙醇溶液)加入一系列不同濃度的芥菜總黃酮提取液，并以蒸餾水為參比，與試劑空白液比較，在510 nm處測量各濃度下的吸光度，便能測定被測物(總黃酮)對OH的清除作用，其清除率計(jì)算公式：清除率()=A0-AxA0100% 以實(shí)驗(yàn)的提取液作為樣品，分別取不同體積的樣品定容到10m1分別測其對OH的清除作用。從圖1中可看出，芥菜總黃酮提取液對由Fent

15、on體系產(chǎn)生的OH有一定的清除作用，隨著芥菜總黃酮提取液濃度的增加，對OH自由基的清除能力也增強(qiáng)，說明當(dāng)黃酮類物質(zhì)的濃度增加時(shí)，其清除率也增大。3 討論 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法工藝簡單，回收率為100.7%，利用本文所提供的超聲波提取、純化方法而得到的黃酮類物質(zhì)其純度較高。超聲波可以強(qiáng)化乙醇浸提法，達(dá)到省時(shí)、高效、節(jié)能的目的，此方法采用全物理過程，無任何污染，是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。 黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見的是黃酮和黃酮醇，其它包括雙氫黃（醇）、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮

16、類等6。天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，能進(jìn)入脂肪組織，進(jìn)而體現(xiàn)出如下功能：消除疲勞、保護(hù)血管、防動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能。 黃酮類化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用7，8。近年來，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)倍受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引人矚目。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芥菜中含有較為豐富的黃酮，其提取物總黃酮對羥自由基具有很好的清除作用。因此，有廣泛的開發(fā)和利用價(jià)值，值得綜合利用，加強(qiáng)資源開發(fā)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1吳文青，李正軍.食用本草M.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2003：65.2夏杏洲，張 輝，魏傳晚.榕樹葉中黃酮類化合物的提取條件研究J.食品研究與開發(fā),2002,23(5):35.3謝麗玲，朱炎坤. 葉芥菜中總黃酮含量測定的研究J.儀器儀表與