腦心康片對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)基因細(xì)胞間黏附分子表

1、腦心康片對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)基因細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的影響 作者：蘇云明張學(xué)會(huì)李環(huán)李卉孟妍【摘要】 目的觀察腦心康片對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。方法Wistar大鼠雄性70只，按照體重隨機(jī)分為7組，每組10只。即腦心康片高劑量組、中劑量組、低劑量組，尼莫地平組，銀杏葉片組，模型組和假手術(shù)組。各組均連續(xù)灌胃給藥7 d（模型組和假手術(shù)組予等體積生理鹽水）。末次給藥30 min后，除假手術(shù)組外各組采用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法制備不完全腦缺血模型，觀察腦心康片給藥前后大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)大鼠神經(jīng)功能缺損導(dǎo)致的行為學(xué)變化；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦心康片對(duì)腦缺血后24，

2、48，72 h腦組織細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果腦心康片能明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，抑制ICAM-1蛋白的表達(dá)。結(jié)論腦心康片對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用，遵循一定的時(shí)-效關(guān)系和量-效關(guān)系，其機(jī)理可能與腦心康片通過抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 腦心康片；腦缺血；再灌注損傷；細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞間黏附分子-1Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of Naoxinkang-tablet on cerebral ischemia reperfusion injury in rat

3、s and its mechanism.MethodsThe model of incomplete cerebral ischemia were induced by occluding the middle cerebral artery occlusion (MCAO). The protein expression of ICAM-1 was immunohistochemical method at 24 h, 48 h and 72 h after cerebral ischemia.ResultsNaoxinkang-tablet could obviously improve

4、detected by symptoms of the neurological deficit in cerebral ischemia rats, inhibit the expression of ICAM-1. ConclusionNoxinkang-tablet has protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury in time and dose dependent manners by inhibiting ICAM-1 expression and anti-inflammation.Key words:Na

5、oxinkang-tablet；Cerebral Ischemia；Reperfusion injury；Cell Apoptosis； ICAM-1 腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，是目前引起人類死亡的三大疾病之一。缺血性腦卒中是多種原因引起的一種臨床病理狀態(tài),其腦組織損害是產(chǎn)生臨床征象的病理基礎(chǔ)。在本病的預(yù)防、治療和康復(fù)方面，中醫(yī)藥具有較為顯著的療效和優(yōu)勢(shì)。臨床應(yīng)用腦心康片治療腦缺血，取得滿意療效1。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠腦神經(jīng)損傷的行為學(xué)改變、凋亡相關(guān)基因ICAM-1蛋白表達(dá)的觀察，探討腦心康片對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。1 材料與儀器1.1 動(dòng)物Wista

6、r大鼠，雄性，體重（20020）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：黑動(dòng)字P00101006。大鼠自由進(jìn)食、飲水，同等條件下飼養(yǎng)，手術(shù)前12 h禁食，不禁水。1.2 藥品與試劑腦心康片由蝙蝠葛酚性堿50%、水蛭素50%組成，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制備；尼莫地平片，天津中央藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0701001；銀杏葉片，唐山榮大藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)050304。Rabbit Anti CD54（ICAM-1）（BA2189），稀釋度：1100（武漢博士德生物工程有限公司）。HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素-親和素SP試劑盒、 S/P三步法檢測(cè)試劑盒（批號(hào)50881774）、PV600

7、1二步法檢測(cè)試劑盒（批號(hào)1360）、兔抗山羊IgG/HRP（批號(hào)C0206）、 山羊抗鼠IgG/HRP（批號(hào)N045036）、 DAB顯色試劑盒 （批號(hào)60882801），均有北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。1.3 儀器生物組織攤烤片機(jī)、生物組織包埋機(jī)（湖北孝感）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海福瑪）；光學(xué)顯微鏡（Olympus Japan BH-2）；Q500IW圖像分析儀（ 德國(guó)Leica）；醫(yī)用圖像分析處理系統(tǒng)（華海電子有限公司）。2 方法2.1 分組及給藥方法清潔級(jí)雄性Wistar大鼠70只，體重（20020）g，按照體重隨機(jī)分為7組，每組10只。即腦心康片高劑量組（100 mg/kg），腦心

8、康片中劑量組（50 mg/kg），腦心康片低劑量組（25 mg/kg），尼莫地平治療組（21.6 mg/kg），銀杏葉片組（135 mg/kg），模型對(duì)照組和假手術(shù)組（分別給等體積生理鹽水）。各組均連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥30 min后手術(shù)。2.2 大鼠腦缺血再灌注模型制備采用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法制備不完全腦缺血模型，末次給藥30 min 后，用10%水合氯醛350 mg?kg-1行腹腔注射麻醉，分離并結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)45 min，然后松開再灌注2 h。假手術(shù)組只暴露血管不結(jié)扎，其余組均按照上述過程操作。2.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)方法在造模手術(shù)完成35 h，待大鼠蘇醒后，能夠完全自主

9、活動(dòng)時(shí)，進(jìn)行第1次神經(jīng)功能評(píng)分；分別于末次給藥后24，48，72 h進(jìn)行第2次神經(jīng)功能評(píng)分。行為學(xué)評(píng)分后處死部分動(dòng)物，快速開胸暴露心臟，剪開右心耳，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈內(nèi)，于5 min內(nèi)快速灌注150 ml左右肝素化生理鹽水；隨后滴注含4%多聚甲醛的0.1 mol?L-1磷酸緩沖液200 ml緩慢灌注固定；灌注完畢，完整取腦，在相同固定液中4固定24 h。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)。2.4 統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)以s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。百事通3 結(jié)果3.1 腦心康片給藥前后各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分情況結(jié)果見表1。表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的基本情況（略） 由表1可

10、見，模型組與假手術(shù)組相比，差異有顯著性意義（P0.01）；給藥后腦心康片高、中、低劑量組與銀杏葉片組相比，差異有顯著性意義（P0.01或P0.05）；給藥后腦心康片高、中、低劑量組與尼莫地平組相比，差異均有顯著性意義（P0.01或P0.05）。3.2 腦心康片對(duì)MCAO大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)的影響結(jié)果見表2及圖1。表2 腦心康片對(duì)MCAO大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)的影響（略） 由表2可見，給藥各組和模型組與假手術(shù)組相比，差異有顯著性意義（P0.01）。從藥物作用強(qiáng)弱對(duì)比看，腦心康片高劑量在3個(gè)用藥時(shí)間段抑制的作用與尼莫地平組相當(dāng)，兩組比較，差異有顯著性意義（P0.05），明顯優(yōu)于銀杏葉片組

11、，兩組比較，差異也有顯著性意義（P0.05或P0.01）；腦心康片中、低劑量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)抑制作用與尼莫地平組相當(dāng)或略弱（P0.05），但與銀杏葉片給藥組比較，差異無顯著性意義（P0.05）。腦心康片同一時(shí)間點(diǎn)的高、低劑量組比較差異顯著（P0.01）；且腦心康片高、中、低劑量用藥72 h的作用優(yōu)于給藥24 h的作用，差異有顯著性意義（P0.05）。 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，所有藥物治療組與模型組及假手術(shù)組比較，均有顯著性差異（P0.05或P0.01）。 腦組織切片中，ICAM-1免疫陽(yáng)性染色見于梗死灶周圍腦組織內(nèi)微血管和毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞，表現(xiàn)為血管壁內(nèi)皮細(xì)胞棕黃染色。假手術(shù)組極少見ICAM-1陽(yáng)性染色血管

12、；模型對(duì)照組及藥物治療組均有不同程度ICAM-1陽(yáng)性反應(yīng)血管。模型對(duì)照組在24，48，72 h內(nèi)陽(yáng)性染色血管隨時(shí)間推移，逐漸減少，但與假手術(shù)組比較均有顯著性差異（P0.01），說明在缺血24 h后，ICAM-1表達(dá)達(dá)到高峰后，持續(xù)高位表達(dá)，腦缺血部位炎癥反應(yīng)較重（見圖28）。 4 討論 腦缺血時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制目前仍不十分清楚。但大量的研究表明，缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，并發(fā)現(xiàn)了許多與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的調(diào)控基因，主要有Caspase家族、Bcl-2蛋白家族、ICAM、IEGs和p53基因等2。ICAM-1是Rothelein等于1986年首次發(fā)現(xiàn)鑒定的一種淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原

13、-1的配體，是一種單鏈跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族3。ICAM-1可介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附以及白細(xì)胞穿出血管壁。ICAM-1在靜息的白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞上呈低水平表達(dá)，但在致炎性細(xì)胞因子刺激下表達(dá)可迅速上調(diào)，并以血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)4。急性腦缺血時(shí)，在炎性細(xì)胞因子的刺激下，ICAM-1的表達(dá)顯著升高，與白細(xì)胞表面表達(dá)的配體CD11/CD18和CD11b/CD18相結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，發(fā)生無復(fù)流現(xiàn)象，并介導(dǎo)白細(xì)胞游出血管，產(chǎn)生FR、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子等，造成組織進(jìn)一步損傷，ICAM-1在腦缺血后白細(xì)胞介導(dǎo)的腦缺血早期炎癥損傷機(jī)制中發(fā)揮著重要作用5

14、。持續(xù)局部腦缺血后1 h ICAM-1 mRNA的表達(dá)即開始上調(diào)，缺血后6 h達(dá)高峰，其高峰時(shí)間可維持24 h3。持續(xù)局灶性腦缺血3 h，ICAM-1的蛋白表達(dá)水平開始增高，24 h達(dá)高峰，持續(xù)至120 h6。ICAM-1表達(dá)上調(diào)亦是NF-B結(jié)合到ICAM-1基因啟動(dòng)子上NF-B目標(biāo)序列TG-GAAATTCC以后激活表達(dá)所致。阻斷NF-B的激活，可抑制ICAM-1的表達(dá)和白細(xì)胞的跨膜遷移7?？寡趸瘎┩ㄟ^抗OFR而阻斷NF-B激活，亦可抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá)8。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦心康片具有明顯的抗腦缺血、抑制ICAM-1表達(dá)的作用，且該作用遵循一定的量-效關(guān)系?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1丁

15、正同，蔣雨平.臨床顱腦病學(xué)M.天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2003:361.2Li Y, Chopp M, Powers C, et al. Apoptosis and protein expression after focal cerebral ischemia reperfussion in rats J.Brain Res, 1997, 765（2）: 301 .3郝延磊，蒲傳強(qiáng)，朱克，等.細(xì)胞間粘附分子1和E選擇素在局部腦缺血中的作用J.中華老年心腦血管病雜志，2000，2（1）：54.4Sobel RA, Mitchell ME, Fonder G. Intercellular ad

16、hesion molecule (ICAM-1) in cellular immune reactions in the human central nervous systemJ.Am-J-Pathol, 1990,136(6):1309.5吳珊，董為偉，董佑忠. 局灶腦缺血再灌流后ICAM-1表達(dá)與白細(xì)胞浸潤(rùn)J.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2000，17（1）：5.6郝延磊,，蒲傳強(qiáng)，張鳳英，等. 實(shí)驗(yàn)性腦缺血模型腦組織微血管細(xì)胞間粘附分子1表達(dá)的研究J.中華神經(jīng)科雜志，1998，31（2）：105.7Chen CC, Rosenbloom CL, Imuro Y, et al. Ihibition of NF kappaB in activated rat hepatic stallate cells by proteasome inhibitors and an IkappaB super-repress