實驗十一蛋白質(zhì)脫鹽

1、實驗十一蛋白質(zhì)脫鹽(透析和凝膠過濾 )在蛋白質(zhì)的研究中，經(jīng)常要進行蛋白質(zhì)脫鹽，即將蛋白質(zhì)同其它鹽類小分子分離開。蛋白質(zhì)脫鹽的方法很多， 各有優(yōu)缺點。 以下僅介紹常用的透析和凝膠過濾方法， 可根據(jù)實驗條件和要求選用。（一）蛋白質(zhì)透析一.目的學(xué)習(xí)透析的基本原理和操作。二 . 原理蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)， 不能透過透析膜而小分子物質(zhì)可以自由透過。 在分離提純蛋白質(zhì)的過程中，常利用透析的方法使蛋白質(zhì)與其中夾雜的小分子物質(zhì)分開。三 . 儀器、試劑、材料1. 儀器燒杯；玻棒；離心機；離心管；冰箱；電爐。2. 試劑1氯化鋇溶液；硫酸銨粉末；1mol/L EDTA ； 2%NaHCO 3。3. 材料透析管（寬約，

2、長1215cm）或玻璃紙 ; 皮筋；雞蛋清溶液：將新鮮雞蛋的蛋清與水按1： 20 混勻，然后用六層紗布過濾。四. 操作方法1. 透析管（前）處理：先將一適當(dāng)大小和長度的透析管放在1mol/L EDTA 溶液中，煮沸 10 分鐘，再在2 NaHCO 3 溶液中煮沸 10 分鐘，然后再在蒸餾水中煮沸10 分鐘即可。2. 取 5ml 蛋白質(zhì)溶液于離心管中， 加 4g 硫酸銨粉末， 攪拌使之溶解。 然后在 4下靜置 20 分鐘，出現(xiàn)絮狀沉淀。3. 離心：將上述絮狀沉淀液以1000 轉(zhuǎn) /分的速度離心 20 分鐘。4. 裝透析管： 離心后倒掉上清夜， 加 5ml 蒸餾水溶解沉淀物， 然后小心倒入透析管中

3、，扎緊上口。5. 將裝好的透析管放入盛有蒸餾水的燒杯中，進行透析，并不斷攪拌。6.每隔適當(dāng)時間 （ 5 10 分鐘），用氯化鋇滴入燒杯的蒸餾水中，觀察是否有沉淀現(xiàn)象。五 . 結(jié)果處理記錄并解釋實驗現(xiàn)象。六 . 注意事項1. 硫酸銨鹽一定要充分溶解，才能使蛋白質(zhì)沉淀下來。七. 思考題在透析袋處理過程中，EDTA 和 NaHCO 3 起何作用？（二）凝膠過濾一 . 目的學(xué)習(xí)凝膠過濾的基本操作技術(shù)，了解凝膠過濾脫鹽的原理和應(yīng)用。二 .三 .原理凝膠過濾的主要裝置是填充有凝膠顆粒的層析柱。目前使用較多的凝膠有葡聚糖凝膠（ Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）和聚丙烯酰胺凝膠（Bio-g

4、el-P ）等。這些多聚高分子材料 ,通過適當(dāng)濃度的交聯(lián)劑作用即產(chǎn)生分子間橫向的交聯(lián)，形成具有一定孔徑的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。當(dāng)用這類材料制成粒狀凝膠顆粒后，顆粒內(nèi)部就形成一種三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些凝膠材料是高度親水的，在水溶液里吸水顯著膨脹。實際工作中常用每克干膠吸水量（ ml ）的 10 倍（ G 值）表示凝膠的交聯(lián)度，可根據(jù)被分離物質(zhì)分子的大小和工作目的，選擇適合的凝膠型號。當(dāng)在柱頂加上分子大小不同的混合物并用洗脫液洗脫時，自由通透的小分子可以進入膠粒內(nèi)部，而受排阻的大分子不能進入膠粒內(nèi)部。二者在洗脫過程中走過的路程差別較大，大分子只能沿著膠粒之間的間隙向下流動，所經(jīng)路程短，最先流出。而滲入膠粒內(nèi)部的小

5、分子受迷宮效應(yīng)影響，要經(jīng)過層層擴散向下流動，所經(jīng)路程長，最后流出。通透性居中的分子則后于大分子而先于小分子流出。從而按由大到小的順序?qū)崿F(xiàn)大小分子分離。凝膠過濾的操作條件溫和，適于分離不穩(wěn)定的化合物；凝膠顆粒不帶電荷，不與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，因而溶質(zhì)回收率接近100，而且設(shè)備簡單、分離效果好、重現(xiàn)性好，凝膠柱可反復(fù)使用，所以廣泛使用于蛋白質(zhì)等大分子的分離純化、分子量測定、濃縮、脫鹽等用途。本實驗利用凝膠過濾的特點，將(NH 4)2SO4 鹽同蛋白質(zhì)分子分離開。儀器、試劑、材料1. 儀器層析柱（ 2cm× 15cm） ;真空泵；真空干燥器；恒流泵；核酸蛋白檢測儀；部分收集器；記錄儀。2.

6、 試劑1氯化鋇溶液；硫酸銨粉末；Sephadex G-25。3. 材料雞蛋清溶液：將新鮮雞蛋的蛋清與水按1： 20 混勻，然后用六層紗布過濾。四 . 操作方法1.凝膠溶脹：取 5 g Sephadex G-25, 加 200ml 蒸餾水充分溶脹（在室溫下約需6 小時或在沸水浴中溶脹 5 小時）。待溶脹平衡后，用傾瀉法除去細小顆粒，在加入與凝膠等體積的蒸餾水，在真空干燥器中減壓除氣，準(zhǔn)備裝柱。2.裝柱：將層析柱垂直固定，旋緊柱下端的螺旋夾，加入1/4 柱長的蒸餾水。把處理好的凝膠連同適當(dāng)體積的蒸餾水用玻棒攪勻，然后邊攪拌邊倒入柱中，同時開啟螺旋夾控制一定流量。最好一次連續(xù)裝完所需的凝膠，若分次裝

7、入，需用玻棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面影響分離效果。最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的濾紙片保護凝膠床面。3.平衡：繼續(xù)用蒸餾水洗脫，調(diào)整流量使膠床表面保持2cm 液層，平衡 20 分鐘。4.樣品制備：取5ml 蛋白質(zhì)溶液于離心管中，加4g 硫酸銨粉末，攪拌使之溶解。然后在 4下靜置20 分鐘，出現(xiàn)絮狀沉淀。將上述絮狀沉淀液以1000 轉(zhuǎn) /分的速度離心 20 分鐘，離心后倒掉上清夜，加5ml 蒸餾水溶解沉淀物，即為樣品。5. 上樣：當(dāng)膠床表面僅留約 1mm 液層時，吸取 1ml 樣品，小心地注入層析柱膠床面中央，慢慢打開螺旋夾，待大部分樣品進入膠床、床面上僅有 1mm 液層時，用乳頭滴管加入少量蒸餾水，使剩余樣品進入膠床，然后用滴管小心加入 35cm 高的洗脫液。6. 洗脫：繼續(xù)用蒸餾水洗脫，調(diào)整流速，使上下流速同步。用核酸蛋白檢測儀檢測，同時用部分收集器收集洗脫液。合并與峰值相對應(yīng)的試管中的洗脫液，即為脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液。7. 用氯化鋇溶液檢測蛋白質(zhì)溶液，評價脫鹽效果。五 . 結(jié)果處理記錄并解釋實驗