熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA與乙肝兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性探討

1、熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA與乙肝兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性探討    摘要：目的：探討HBV-DNA的檢出情況與乙肝兩對(duì)半結(jié)果之間的關(guān)系。方法：運(yùn)用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測(cè)307例疑似乙肝患者血清中的HBV-DNA，同時(shí)運(yùn)用ELISA方法進(jìn)行兩對(duì)半指標(biāo)的檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性探討。結(jié)果：HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+     張蓓， 楊曉云， 劉蕊， 紀(jì)鳳祥 摘要：目的：探討HBV-DNA的檢出情況與乙肝兩對(duì)半結(jié)果之間的關(guān)系。方法：運(yùn)用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測(cè)307例疑似乙肝

2、患者血清中的HBV-DNA，同時(shí)運(yùn)用ELISA方法進(jìn)行兩對(duì)半指標(biāo)的檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性探討。結(jié)果：HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)組（大三陽(yáng)組）患者血清HBV-DNA檢出率為98.15%（53/54），平均拷貝數(shù)為7.56E+06/ml；HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)組（小三陽(yáng)組）患者血清HBV-DNA檢出率為27.78%（15/54），平均拷貝數(shù)為3.79E+05/ml；HBsAg(+)HBcAb(+)組血清HBV-DNA檢出率為91.18%（31/34），平均拷貝數(shù)為2.85E+05/ml，小三陽(yáng)組HBV-DNA陽(yáng)性檢出率及拷貝數(shù)均低于大三陽(yáng)組，且與大

3、三陽(yáng)組比較均具有顯著性差異（P<0.01，P<0.05）；HBsAb()組血清HBV-DNA檢出率為1.6%(1/63)，平均拷貝數(shù)為1.13E+08/ml ；HBcAb(+) 組血清HBV-DNA檢出率為16.67%(1/6)，平均拷貝數(shù)為3.00E+04/ml；HBsAb() HBeAb()HBcAb()組血清HBV -DNA檢出率為12.50%(4/32)，平均拷貝數(shù)為3.00E+05/ml；HBsAg(+)組血清HBV-DNA檢出率為0（0/2）；HBV-M全陰性組HBV-DNA檢出率為1.61%（1/62），平均拷貝數(shù)為2.75E+05/ml。結(jié)論：HBV-M陰性患者仍有

4、HBV-DNA陽(yáng)性者，因此在檢測(cè)中應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，提高檢出率，避免漏診，為臨床HBV感染、復(fù)制及傳染性的判斷以及指導(dǎo)治療提供更為可靠的判定依據(jù)。   關(guān)鍵詞：  常規(guī)檢查；  HBV-DNA；  熒光定量PCR   Correlation of Detection of HBV-DNA by Fluorescent Quantitative PCR with Routine Detection of HBV   ZHANG Bei，  YANG Xiao-yun，  LIU Rui，  et

5、al   (Tianjin People's Hospital, Tianjin 300121，China)   Abstract：Objective：To explore the relationship between detection of HBV-DNA and routine detection of HBV.Method：HBV-DNA was detected with fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) and HBV was routinely determined with ELISA in serum

6、samples from 307 suspected cases of hepatitis B.Meanwhile ,the correlation of results between the two methods was analyzed.Result：The detecting rate of HBV-DNA was 98.15% (53/54) and the mean copy number was 7.56E+06/ml in patients of  HBsAg(+),HBeAg(+) and HBcAb(+) (group A), 27.78%（15/54）and

7、3.79E+05/ml in patients of HBsAg(+),HBeAb(+) and HBcAb(+) (group B), 91.18%（31/34）and 2.85E+05/ml in patients of  HBsAg(+) and HBcAb(+) (group C).The 2 parameters were significantly lower in group B than in group A(P<0.01 and 0.05).Furthermore,they were respectively 1.6%(1/63) and 1.13E+08/m

8、l in patients of HBsAb(), 16.67%(1/6) and 3.00E+04/ml in patients of  HBcAb(+),12.50%(4/32) and 3.00E+05/ml in patients of HBsAb(), HBeAb() and HBcAb(),0(0/2) in patients of HBsAg(+) and 1.61%（1/62）and 2.75E+05/ml in HBV-M- negative patients.Conclusion：HBV-DNA positivity may appear in HBV-M- ne

9、gative patients.Therefore,the 2 methods should be simultaneously used in the detection of HBV infection to promote the detecting rate to provide more reliable evidence for judgment of HBV infection,duplication and infectivity and its treatment in clinical practice.   Key words：  Routine de

10、tection;  HBV-DNA;  Fluorescent quantitative PCR   乙型肝炎是世界上最常見的傳染病之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，本病每年造成100萬(wàn)人死亡1。慢性乙型肝炎是HBV感染的一種嚴(yán)重后果。HBV-DNA是直接反映乙肝病毒存在、活動(dòng)性復(fù)制及具有傳染性的可靠指標(biāo)2。但目前我國(guó)現(xiàn)狀HBV感染者多以其血清感染標(biāo)志物（乙肝兩對(duì)半，HBV-M）判定，由于其組合模式復(fù)雜多樣，從而導(dǎo)致了臨床上對(duì)部分發(fā)病患者的HBV感染復(fù)制狀況難以判斷，有時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)漏診的情況。定量PCR法的應(yīng)用，使得我們進(jìn)行HBV-DNA的檢測(cè)的同時(shí)得以對(duì)其進(jìn)行相

11、對(duì)的量化，這對(duì)于乙肝患者體內(nèi)的HBV的復(fù)制以及傳染性有更直接的了解，同時(shí)也更有利于對(duì)臨床HBV感染的診斷、治療方案的選擇及療效的判斷。本文采用熒光定量PCR(FQ-PCR)對(duì)307例疑似乙肝患者標(biāo)本血清的不同HBV血清學(xué)標(biāo)志物組合進(jìn)行了HBV-DNA檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以探討HBV-M與HBV-DNA復(fù)制水平的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下：   1  資料與方法   1.1  標(biāo)本來(lái)源：均系2004年7月至2005年8月到我院就診的所有同時(shí)做過(guò)乙肝兩對(duì)半及HBV-DNA檢測(cè)的疑似乙肝的門診和住院患者，共307例，其中女129人，男178人，年齡1778歲

12、，平均39歲。   1.2  檢測(cè)儀器   1.2.1  LightCycler定量擴(kuò)增儀（德國(guó)）。   1.2.2  Alisei全自動(dòng)酶標(biāo)儀（德國(guó)）。   1.3  檢測(cè)方法和試劑   1.3.1  HBV-M檢測(cè)：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)，試劑由上海榮盛生物技術(shù)有限公司提供，并嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。   1.3.2  HBV-DNA定量分析：采用熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測(cè)，試劑由上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司提供，嚴(yán)格按說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作。 

13、0; 1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：根據(jù)HBV血清標(biāo)志物分為8組，將各組的HBV-DNA拷貝數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，以指數(shù)表示(±S)，定量測(cè)量范圍仍用實(shí)際檢測(cè)值表示；采用X2檢驗(yàn)進(jìn)行組間HBV-DNA陽(yáng)性率顯著性檢驗(yàn)，采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)比較拷貝數(shù)。   2  結(jié)果   2.1  HBV-DNA定量測(cè)定結(jié)果：307例疑似乙肝患者血清標(biāo)本中，106例HBV-DNA陽(yáng)性，201例陰性，陽(yáng)性最低拷貝數(shù)為1.30E+03copy/ml，最高拷貝數(shù)為7.70E+09copy/ml。   2.2  HBV-DNA定量測(cè)定與HBV-M的關(guān)系

14、，見表1。   表1  ELISA法檢測(cè)HBV-M和熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA結(jié)果（略）   注：*與大三陽(yáng)組比較P<0.01，#與大三陽(yáng)組比較P<0.05   3  討論   FQ-PCR是進(jìn)行臨床基因診斷的有效手段，它采用了完全閉管檢測(cè)，不需要PCR后處理，避免了交叉感染；同時(shí)采用實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，所得Ct值和原始模板數(shù)量完全呈線形相關(guān)，定量準(zhǔn)確率極高3，它不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應(yīng)用，可以通過(guò)光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光

15、譜的高精確性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn)4。 ELISA法檢測(cè)乙肝兩對(duì)半是臨床診斷HBV感染的傳統(tǒng)手段，它檢測(cè)的是人體對(duì)HBV的免疫反應(yīng)狀態(tài)，而FQ-PCR則可以準(zhǔn)確的反應(yīng)出HBV-DNA的復(fù)制水平、病程變化和治療恢復(fù)情況等。本文結(jié)果顯示，54例大三陽(yáng)組中，其HBV-DNA陽(yáng)性53例，檢出率達(dá)98.15%，而且呈較高的拷貝量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理大三陽(yáng)組和HBsAg(+)HBcAb(+)組與小三陽(yáng)組有顯著性差異，說(shuō)明這些患者HBV具有較高的復(fù)制水平，是具有傳染性的重要標(biāo)志。     54例小三陽(yáng)血清中15例檢出HBV-DNA陽(yáng)性，檢出率為27.78%，平均拷貝數(shù)達(dá)到3.7

16、9E+05拷貝數(shù)/ml，雖然其拷貝數(shù)和陽(yáng)性率均低于大三陽(yáng)組，但仍然具有較強(qiáng)的傳染性，說(shuō)明HBeAb的存在并不表示患者體內(nèi)沒有病毒復(fù)制，與既往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果吻合。 在34例HBsAg(+)HBcAb(+)血清中，有31例檢出HBV-DNA陽(yáng)性，檢出率為91.18%,平均拷貝數(shù)為2.85E+05/ml，提示該組中的病人仍具有較強(qiáng)的病毒復(fù)制，傳染性強(qiáng)，此情況可能為血清轉(zhuǎn)換期或前C區(qū)突變，如果經(jīng)過(guò)動(dòng)態(tài)觀察，仍表現(xiàn)HBsAg(+)HBcAb(+)及HBV-DNA陽(yáng)性，可能為前C區(qū)突變5。 在63例HBsAb(+)血清中，仍檢測(cè)出1例HBV-DNA陽(yáng)性，檢出率為1.6%，平均拷貝數(shù)為1.13E+08拷貝數(shù)/

17、ml，6例HBcAb(+)血清中1例檢出HBV-DNA陽(yáng)性，檢出率為16.67%，平均拷貝數(shù)3.00E+04拷貝數(shù)/ml，說(shuō)明HBsAb產(chǎn)生和HBeAg轉(zhuǎn)陰并不意味著病毒的復(fù)制停止或減弱。有學(xué)者認(rèn)為此現(xiàn)象有可能與HBV-DNA前C區(qū)發(fā)生突變有關(guān)，出現(xiàn)“免疫逃逸”或不同亞型的HBV重疊感染6。也有學(xué)者證明乙型肝炎HBsAb出現(xiàn)后，血清內(nèi)仍有DNA復(fù)制，隨著時(shí)間的推移HBV-DNA的檢出率逐漸下降7，8。 62例乙肝兩對(duì)半全陰性的病人中仍有1例HBV-DNA陽(yáng)性，平均拷貝數(shù)為2.75E+05拷貝數(shù)/ml，陽(yáng)性率為1.61%，據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)HBV-DNA的出現(xiàn)早于其他血清標(biāo)志物，因此該l例受檢

18、者可能處于早期感染9。乙肝兩對(duì)半標(biāo)志物全陰性的病人不能排除HBV感染。因此PCR的高靈敏度可作為早期診斷HBV感染提供依據(jù)，提示在臨床上對(duì)HBV-M均陰性者，有進(jìn)一步進(jìn)行HBV-DNA、FQ-PCR檢測(cè)的必要，以確立有無(wú)HBV感染。   綜上所述，本研究結(jié)果表明，PCR與ELISA兩種方法檢測(cè)HBV感染與復(fù)制，多種血清學(xué)標(biāo)志物模式都有一定的HBV-DNA檢出率，由于DNA陽(yáng)性表示HBV在體內(nèi)復(fù)制，如果僅以HBV-M的檢測(cè)結(jié)果作為判斷HBV-DNA感染、傳染性以及HBV是否在體內(nèi)復(fù)制有一定的局限性，因此，為臨床提供HBV感染、復(fù)制及傳染性判斷以及指導(dǎo)治療和觀察療效，我們應(yīng)選擇乙肝兩對(duì)半

19、標(biāo)志物并同時(shí)做HBV-DNA的熒光定量PCR檢測(cè)。   參考文獻(xiàn)：   l  Davey S.State of the Worlds Vaccines and Immunization.Geneva:World Health Organization,199676.   2  彭文偉,主編.病毒性肝炎研究M.廣州:廣東科技出版社,19983.   3  程剛,何蘊(yùn)韶,周新宇.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)乙型肝炎病毒J.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1999,22(3):135.   4  孫靜,陳曲渡,張林林,等.乙肝標(biāo)志物模式與HBV-DNA定量的分析比較J.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,11(8):750.   5  Rodriguez FF,et al.Hepatitis virus infection:precore mutants and its relation to vi