HBV全基因組克隆轉(zhuǎn)染細胞系的建立

1、HBa基因組克隆轉(zhuǎn)染細胞系的建立作者：趙艷芳，閆永平，蘇海霞，王安輝，張磊，張景霞，門可，徐德忠【關(guān)鍵詞】肝炎病毒 , 乙型；基因組, 病毒；克隆, 分子；轉(zhuǎn)染；細胞培養(yǎng)；基因表達【 Abstract 】 AIM: To construct a new cell culture system for producing HBVin : Fulllength HBVDNAwas cloned into pcDNA3vector (named pcDNA33HBV). HepG2 cells were transfected with pcDNA33HBV and screened with an

2、tibiotic G418. HBsAgand HBeAgwere identified by ELISA and HBcAg was identified by immunocytochemical staining. S gene mRNAexpression was tested by RTPCR and HBV DNA in the supernatant of transfected cells was tested by PCR. RESULTS: The plasmid pcDNA33HBV was constructed successfully. After stable t

3、ransfection, HBsAg and HBeAg could be detected in the supernatant of transfected cells. HBcAgpositive staining was located mainly in the cytoplasm. S gene mRNAexpression was verified. S gene and preS gene could be detected in the supernatant by RTPCR. The copies of HBV genome can reach 1 x 108 copie

4、s/L detected by realtime quantitative PCR. CONCLUSION: Rebinant plasmid pcDNA33HBV could be expressed, transcribed and replicated in HepG2 cells. Thistransfectionbased cell culture system could produce high copies of HBV genome.【 Keywords】 hepatitis B virus; genome, viral; cloning, moleculor; transf

5、ection; cell culture;gene expression【摘要】 目的：建立HBVfr外細胞培養(yǎng)體系.方法：構(gòu)建HBVir基 因克隆質(zhì)粒pcDNA33HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG卻月fi, G418篩選.ELISA檢測細胞上 消液HBsAg HBeAg勺表達，免疫組化檢測細胞內(nèi)HBcAg的表達，RTPC檢測細胞S基因mRNA勺表達，PCR僉測細胞上清液DNA.結(jié)果：成功構(gòu)建了 HBVir基 因克隆質(zhì)粒pcDNA33HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2t,培養(yǎng)上清HBsAg HBeAgW生，細 胞內(nèi)HBcA#核漿型分布，且以漿型分布為主.RTPC恥實有HBVS基因mRNA的 表達，上清中HBVS及

6、前S基因陽性，熒光定量PCR僉測顯示培養(yǎng)上清中HBV滴 度達1乂108拷貝/匚 結(jié)論：重組質(zhì)粒pcDNA33HBV在HepG農(nóng)田胞中表達、轉(zhuǎn) 錄、復(fù)制，該細胞培養(yǎng)體系能產(chǎn)生較高水平的HBV.【關(guān)鍵詞】肝炎病毒，乙型；基因組，病毒；克隆，分子；轉(zhuǎn)染；細胞培養(yǎng)；基因表達0 引言由于HBVt主范圍窄、動物模型缺乏，體外組織培養(yǎng)也一直沒有太大進 展，且不能在體外人工培養(yǎng)，制約了對 HBV勺研究1 1.將HBV DNA專移至靶 細胞，建立表達HBV的體外培養(yǎng)細月fi模型對研究HBVft物學(xué)特性和肝炎發(fā)病機制 有重要意義2-4 . HBV基因組呈雙鏈閉合環(huán)狀，基因結(jié)構(gòu)緊湊，具開放讀框 分布于全長DNA為使

7、完整的轉(zhuǎn)染基因能在細胞內(nèi)復(fù)制，目的基因的長度要大于 一個HBV DNAI元5-6.我們構(gòu)建3倍HBV®因的重組真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 細胞，以篩選獲得穩(wěn)定表達病毒蛋白的細胞模型，并研究其產(chǎn)生HBV的水平.1 材料和方法材料HBVr基因亞克隆載體 pUC193HBVJ pUC19ft EcoRI及Hind出位點中插入頭尾相連的HBV（ adr 亞型）三連體，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所張秋博士惠贈，保存在大腸桿菌 DH5x中.真核細胞表達載體pcDNA3*第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室趙晶博士惠贈；人肝母細胞瘤細胞系（HepG2由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈， 本室傳代培養(yǎng)；內(nèi)切

8、酶EcoRI , Hindm, T4 DNA1接酶,Taq DNAi5合酶，反轉(zhuǎn)錄酶及 DNAmarker （TakaRa公司）； 質(zhì)粒提取試劑盒（西安市萊博科技發(fā)展有限公司）； LipofectamineTM 20XX（Invitrogen 公司）；DMEM?養(yǎng)基，G418 （Gibco公司）；新生小牛血泊（杭州 四季青生物制品有限公司）；ELISA檢測試齊I盒（上海科華生物工程股份有限公司）；SABCfe疫組化11m盒，DA琛色劑（武漢博士德生物 工程有限公司）；S基因，B actin及HBV前S/S基因引物均由北京賽百勝公司 合成 .方法和pcDNA3勺酶切鑒定及目的基因片段的獲得過夜培

9、養(yǎng)pUC193HB討口pcDNA3以質(zhì)粒提取試劑盒抽提制備 pUC193HBW pcDNA3分另以EcoRI , Hindm單酶切 pUC193HBV以 EcoRI , Hind m雙酶切 pUC193HBW pcDNA3 瓊 脂糖凝膠電泳分離目的基因，利用膠回收試劑盒回收9600 bp HBS長基因片段和線性 pcDNA3.重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 HBV DNAf線性pcDNA”濃度比3 ： 1混合， 在T4 DNA連接酶彳用下4c連接16 h.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 DH5x .隨機 調(diào)取抗性菌落，經(jīng)小量擴增，提取質(zhì)粒，分別以 EcoRI , Hind田單酶切并以二 者雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳

10、鑒定后送北京三博遠志生物技術(shù)有限公司進行序列測定.脂質(zhì)體介導(dǎo)下pcDNA33HBV因轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一日將處于對數(shù)生長期的HepG卸胞用胰酶消化并換無抗生素的 DMEM&養(yǎng)基，將細胞接種于24孔板，密度達90%時進行轉(zhuǎn)染. 轉(zhuǎn)染方法按說明書進行. 24 h 后傳代， 48 h 換含600 mg/L G418培養(yǎng)基進行篩選.設(shè)未轉(zhuǎn)染的HepG農(nóng)田胞為對照.待對照組細胞全部死亡后，用含300 mg/L G418 的培養(yǎng)基維持. 篩選過程不含其他抗生素.測抗原表達取轉(zhuǎn)染細胞的上清液用 ELISA法測HBsAg HBeAg.操作及 結(jié)果判定按ELISA試劑盒說明書進行，終止反應(yīng)后10 min內(nèi)用酶標(biāo)

11、儀檢測A450 nm值.染色法檢測細胞中HBcAg的表達Triton X100處理，封閉非特異性抗原 反應(yīng)，依次加入一抗（兔抗人HBcmAb、生物素化的二抗（羊抗兔IgG）和SABC 復(fù)合物，DABS色，脫水透明,封片觀察.檢測細胞中S基因mRNA勺表達提取細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以B actin （sense: 5' CCCAGATCATGTTTGAGACQntisense:5' TAGCTCTTCTCCAGGGAGGA3J參照，擴增片段長度為 361 bp. 以S基 因引物（sense: 5 ' CTGCTGGTGGCTCCAGT;Ta3tisense:5&#

12、39; CAATACCACATCATC3CAT做PCFK應(yīng)，擴增產(chǎn)物為500 bp.反應(yīng)條件為94c 預(yù)變性 5 min 后開始循環(huán),94 50 s, 55 50 s, 72 55 s ，共30個循環(huán),最后 72延伸5 min. 瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物.檢測培養(yǎng)上清中DNA攵集轉(zhuǎn)染細胞上清，提取 DNA以車+對HBVni S/S 基因的引物（sense： 5 ' CGGGATCCCATATTCTTGGGAACAAG3 antisense:5' CACTGCAGGGTTTAAATGTATAQCCAR 擴增片段長度為 1200bp， 反應(yīng)條件為94預(yù)變性5 min 后開始循環(huán)，

13、94 45 s, 55 1 min, 722min,共35個循環(huán)，最后72c延伸5 min.設(shè)質(zhì)粒pUC193HBV;陽性對照.熒光定量PCR僉測上清中DNA商度取車專染后48 h、轉(zhuǎn)染后1 mo及轉(zhuǎn)染 后3 mo的細胞上清液（經(jīng)PCR僉測DNAW生）送第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院臨床免 疫科，做熒光定量PCR僉測HBVDNA1度.操作步驟按乙型肝炎核酸擴增熒光檢 測試劑盒說明書進行.結(jié)果判定為HBVDNAW度1X106拷貝/L為陽性，否則為 陰性 .2 結(jié)果,pcDNA*口 pcDNA33HBV酶切鑒定pUC193HB雙酶切后，電泳出現(xiàn)兩 條帶，片段大小約 2900 bp （pUC19和9600 b

14、p （3HBV,單酶切條帶均在 9416 bp與23130 bp之間，pcDNA妝酶切為5400 bp的片段.連接產(chǎn)物雙酶切后，電 泳出現(xiàn)兩條帶，分別為 5400 bp （pcDNA3和9600 bp （3HBV,單酶切條帶均在9416 bp 與 23 130 bp 之間，與預(yù)期結(jié)果相符（圖 1） ，且測序證實連接正確.1,6: pcDNA3 經(jīng) EcoRI 和 Hind m雙酶切;2: pUC193HBV 經(jīng) EcoRI 和 Hind m雙酶切；3: pUC193HBV經(jīng) EcoRI 酶切；4: pUC193HBV經(jīng) Hind m酶切；5, 10: DNA marker 入 Hindm di

15、gest; 7: pcDNA33HBV 經(jīng) EcoRI 和 Hind m雙酶切； 8: pcDNA33HBVS EcoRI 酶切;9: pcDNA33HBV 經(jīng) Hind m酶切.抗G418細胞克隆的形成及篩選轉(zhuǎn)染后 4 wk內(nèi)對照組HepG農(nóng)田胞在G418 的作用下全部死亡，同時轉(zhuǎn)染 pcDNA33HBV HepG2ffi胞陽性克隆形成.挑取陽 性克隆繼續(xù)用G418篩選培養(yǎng)，建立了攜帶 HB"基因的細胞系.SA 法檢測 HBsAgffi HBeAgft達4染 pcDNA33HBV胞組上清中 HBsAg, HBeAgt勻 陽性，而對照組HepG農(nóng)田胞上消始終為陰性.在HepG卸胞中的

16、表達轉(zhuǎn)染pcDNA33HBV細胞內(nèi)HBcAgJ核漿型分布， 以漿型分布為主.未轉(zhuǎn)染的HepG2ffi胞未見染色（圖2）.S基因mRNA!達的檢測以轉(zhuǎn)染細胞 cDNAPCRT增B actin ,在250 bp 與500 bp間可見特異性條帶，說明cDNAW量良好，轉(zhuǎn)染pcDNA33HBV細胞S 基因引物擴增產(chǎn)物為500 bp （ 圖 3）. 對照組細胞未見擴增條帶.培養(yǎng)上消HBV DNA僉測車專染pcDNA33HBV細胞培養(yǎng)上消PCRT增出 1200 bp的陽性條帶，為HBV#異Tt前S/S基因，與陽性對照相同.對照組HepG2 細胞未出現(xiàn)陽性條帶（ 圖 4）.熒光定量PCR僉測上清中DNA商度

17、”專染pcDNA33HBV細胞培養(yǎng)上清中 HBV商度分別為 48 h: 1乂108拷貝兒；1 ma 4X107 拷貝/L; 3 ma 7X 107 拷貝 /L.3 討論隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 將重組基因轉(zhuǎn)入動物細胞并表達已成為確定和分析功能基因產(chǎn)物的有力手段，大大促進了 HBV勺研究.有研究報道，迄今用于 繁殖HBV的所有組織培養(yǎng)系統(tǒng)，都是用串聯(lián)的HBVS因組，常在很強的外源性啟 動子的控制下，這些系統(tǒng)可用于生成大量病毒1 . 我們構(gòu)建的pcDNA33HBV，含完整的頭尾串聯(lián)的HBV基因，載體pcDNA那有CM"期啟動增強子，轉(zhuǎn)染 細胞后，能有效合成和分泌HBsAg HBeAg. R

18、TPCR®示轉(zhuǎn)染細胞有HBV#異性 S基因mRNA勺表達，證實該轉(zhuǎn)染細胞中存在 HBV專錄、復(fù)制過程.且轉(zhuǎn)染細胞 上清中擴增出前S/S基因，即整個S區(qū)，說明有病毒DNA勺存在.其中前S1蛋 白位于完整的病毒顆粒（Dane顆粒）表面，與病毒的裝配和感染密切相關(guān)7,具有與肝細胞受體結(jié)合的位點1 . 由此說明轉(zhuǎn)染細胞可分泌結(jié)構(gòu)較完整的病毒顆粒.熒光定量PCR!一步證明該細胞系能產(chǎn)生較高滴度的HBV DNA.如同細胞系8,該細胞模型可望作為一種新的 HB#外細胞培養(yǎng)體系, 其將為HBV勺后續(xù)研究奠定實驗基礎(chǔ).它的優(yōu)點在于病毒復(fù)制可持續(xù)很長時間， 且可傳代培養(yǎng). 另外， 轉(zhuǎn)染細胞以固定的拷貝數(shù)

19、整合于宿主細胞染色體上，復(fù)制方式有別于自然感染，其不能用于病毒吸附、透過及脫衣殼過程的研究. 國外學(xué)者利用轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)上消感染細胞研究HBV勺感染機制9-10，我們已經(jīng)利用陽性血清成功感染了 HepG農(nóng)田胞11和原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞，將濃縮純化 此細胞分泌的HBV建立接近自然狀態(tài)的HBV®染模型，進行HBV勺感染機制及 胎盤滋養(yǎng)層細胞上特異性受體的研究.【參考文獻】 1 駱抗先 . 乙型肝炎病毒基礎(chǔ)和臨床M . 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 20XX:41-86. 2 Parekh S, Zoulim F, AhnSH, et al. Genomereplication, virion

20、secretion, and e antigen expression of naturally occurring hepatitis B virus core promoter mutants J . J Virol, 20XX,77(12):6601-6612. 3 唐霓 , 黃愛龍 , 張秉強 , 等 . 倍乙型肝炎病毒全基因真核表達載體的構(gòu)建及在HepG2g胞中的表達J.中華肝臟病雜志，20XX,11(8):464-466. 4 Fellig Y, Almogy G, Galun E, et al. A hepatocellular carcinoma cell line produ

21、cing mature hepatitis B viral particles J . BiochemBiophys Res Commun, 20XX,321(2):269-274. 5 Lu X, Block TM, Gerlich WH.Proteaseinduced infectivity of hepatitis B virus for human hepatoblastoma cell line J . J Virol,1996,70(4):2277-2285. 6 倪宏 , 駱抗先 , 朱幼芙 , 等 . 乙型肝炎病毒全基因在肝癌細胞中的轉(zhuǎn)染與表達J . 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,20XX,21(7):501-502. 7 Ryu CJ, Gripon P, Park HR, et al. In vitro ne