piRNA研究進(jìn)展概述

1、PiRNA研究進(jìn)展非編碼小RNA在正常的生物學(xué)過程和人類疾病中均有重要作用(Esteller,Metal.,2011),主要包括microRNAs(miRNA)、short-interferingRNAs(siRNA)和PIWI-interactingRNAs(piRNA)。piRNA的發(fā)現(xiàn)得益于PIWI蛋白家族的研究，這種蛋白是動物繁衍后代所必須的。目前，保守估計(jì)真核生物基因組上大約具有20,000個piRNA(Moyano,Metal.,2015)。piRNA首次在果蠅的睪丸中被鑒定為一種新的長的siRNA(longsiRNA),可以沉默位于果蠅X染色體上的多拷貝基因Stellate(Ar

2、vainetal,2001)。后因與Argonaute蛋白家族亞族PIWI相結(jié)合發(fā)揮作用而得名，由Arvain等采用層析柱法從小鼠睪丸細(xì)胞中分離得到(Arvainetal,2006)。PiRNA是一類片段大小在26-31nt單鏈小RNA,大部分集中在29-30nt,5端具有強(qiáng)烈的單磷酸尿口密噬核甘酸傾向性，3端(22O-methyl)進(jìn)行了甲基化修飾(Kirinoetal.,2007)(Fig1)。Fig1structureofpiRNApiRNA生成機(jī)制研究進(jìn)展已研究的大部分物種中，基因組上散在分布的基因座產(chǎn)生了絕大部分的piRNA,這些基因座被稱為piRNA簇(piRNAcluster)。

3、PiRNA簇根據(jù)能否從基因組上的兩條鏈或一條鏈產(chǎn)生piRNA而分為雙鏈簇和單鏈簇。單鏈簇piRNA是分布最廣泛的也是默認(rèn)的類型。單鏈簇轉(zhuǎn)錄生成piRNA前體與經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄途徑事實(shí)上是難以區(qū)分的，基于二者都具有以下幾個轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：(1)啟動子區(qū)域都有H3K4me2(histon3lysin4dimethylation)標(biāo)志;(2)轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶H(polH)負(fù)責(zé)；(3)經(jīng)典的RNA轉(zhuǎn)錄后加工(5端帽子修飾、剪切、多聚腺甘酸修飾)(GoriauxCetal.,2014)。單鏈簇轉(zhuǎn)錄模式在果蠅中研究的比較清楚。目前，已發(fā)現(xiàn)的主要有兩個單鏈簇20A和flam(BrenneckeJetal.,20072

4、0A在體細(xì)胞濾泡細(xì)胞(somaticfolliclecell)和生殖細(xì)胞中均表達(dá)，flam只在濾泡細(xì)胞中表達(dá)。Flam具有幾個顯著的特點(diǎn)(Fig2):(1)位于常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的邊界；(2)flam中含有g(shù)ypsy家族的TEs;(3)啟動子具有H3K4me2標(biāo)記，簇體具有H3K9me2標(biāo)記。Flam的轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄因子Ci(Cubitusinterruptus)的參與，piRNA前體的剪切產(chǎn)生多個異構(gòu)體，這些異構(gòu)體可以通過UAP56和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nxf1和Nxt1轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的Yb小體進(jìn)行piRNA的成熟和加工(Fig3)。Fig2flamclusterinthefolliclecellsofD

5、rosopbilaovaryNu-：lf=arexportNucleusYbbodypiRJAprecuirOrtrarcnptFig3thetranscriptionofflamcluster雙鏈簇是果蠅生殖細(xì)胞中piRNA生成的主要方式。顧名思義，piRNA前體可以從基因組的兩條鏈生成。這種方式有別于經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄方式，是一種啟動子非依賴的轉(zhuǎn)錄方式，并且不需要剪切和多聚腺甘酸形式的加工。多項(xiàng)研究表明，Rhino(特異性的結(jié)合到piRNA簇的H3K9me2標(biāo)記)，一種異染色體蛋白1(HP1)的同源物(Yu,Betal.,2015),是雙鏈簇轉(zhuǎn)錄的靈魂蛋白。Rhino被認(rèn)為是一種“錨”,與Dead

6、lock(Del)和Cutoff(Cuff)組成復(fù)合物。Rhino-Del招募Moonshiner和TATAbox結(jié)合蛋白相關(guān)因子2(Trf2)到簇的YR元件起始轉(zhuǎn)錄(Malone,C.D.etal,2009;Andersen,P.Retal.,2015)Rhino-Del-Cuff通過抑制剪切和轉(zhuǎn)錄終止來確保簇的轉(zhuǎn)錄的不斷延伸。轉(zhuǎn)錄完成后，piRNA前體通UAP5轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)的nuage區(qū)域進(jìn)行加工(Fig4)。,口一XtrmndgwmlinXtrmndgwmlinr r縹卬叩-叱：*NucllearexportNuclearExpEjCtaph&micnuaqeFig4Flygerm

7、linedual-strandclustersstranscriptionspiRNA前體的加工、成熟發(fā)生在特定的亞細(xì)胞區(qū)域，動物生殖細(xì)胞中稱作naug0需要PIWI蛋白的參與(BrenneckeJetal.,2007LimAKetal.,2007)。體細(xì)胞來源的果蠅卵泡細(xì)胞中被所謂的“Yb小體”替代，位于核膜的胞質(zhì)一側(cè)(MurotaYetal.,2014;QiHetal.,2011)。依據(jù)最新的研究表明，成熟piRNANucleus-J*l.slLral5JUAUAg gb bSpikingSpikingfUAP56SplicingstallsLJAPS6piRNApiRNAprecurso

8、r(ran(ranscriptscriptllcWGlzr-neTNucLeuft的生成根據(jù)是否依賴于Zuc而分成兩種途徑，一種是Zuc介導(dǎo)的途徑，另一種是Zuc非依賴的生成途徑。核酸內(nèi)切酶Zuc/MitoPLD,位于線粒體外膜， 通過結(jié)構(gòu)及小RNA遺傳與生信分析表明。其在piRNA生成途徑中的核心地位。Zuc不僅參與到了piRNA5端的形成，還直接或間接的參與到3端的產(chǎn)生（Han,B.Wetal.,2015）。隨著piRNA簇每隔25nt進(jìn)行剪切時(shí)，果蠅中Zuc的活性表現(xiàn)出一種顯著的持續(xù)性bi變化。止匕外，在整個加工過程中PIWI蛋白都參與其中，但是PIWI的加載和Zuc剪切之間的關(guān)聯(lián)還不清

9、楚。Zuc介導(dǎo)的途徑主要由以下兩個階段合作完成：（1）“乒乓循環(huán)機(jī)制”；（2）Zuc依賴的拖尾piRNA生成途徑?！捌古已h(huán)機(jī)制”剪切piRNA前體轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)生5端單磷酸基團(tuán)的pre-pre-piRNA,為Zuc依賴的拖尾piRNA生成途徑提供底物。“乒乓循環(huán)機(jī)制”具體過程（Fig5）:（1）Aub結(jié)合到piRNA（反義鏈）形成復(fù)合物去識別并剪切轉(zhuǎn)座子mRNA,隨后較短的剪切產(chǎn)物被裝載到Ago3蛋白，發(fā)生剪切并產(chǎn)生Ago3-piRNA（正義鏈）復(fù)合體前體，通過Nbr對3端進(jìn)行修飾成熟。成熟的Ago3-piRNA（正義鏈）復(fù)合體識別和剪切piRNA前體轉(zhuǎn)錄本， 剪切的產(chǎn)物又可以起始新一輪的循環(huán)，

10、 不斷的產(chǎn)生Zuc依賴的拖尾piRNA生成途徑的底物。 整個循環(huán)過程中， 特定的復(fù)合物 （如VasaKrimp、Qin、Spn-E）的裝載確保剪切產(chǎn)物被裝載到不同的PIWI蛋白（Aub/Ago3）上。PiRNA的生成以3方向的形式進(jìn)行，Zuc以每隔25nt的形式剪切產(chǎn)生拖尾piRNA,該過程中由多個因子參與其中，但是其中的具體機(jī)制還不清楚（Fig5）o最后，Hen1對拖尾piRNA進(jìn)行修飾產(chǎn)生成熟的piRNA。Zuc非依賴的piRNA生成途徑主要在果蠅的卵巢中發(fā)現(xiàn)， 哺乳動物和家蠶中很稀有。上文提到，“乒乓循環(huán)機(jī)制”與Zuc介導(dǎo)的途徑共同完成成熟piRNA的產(chǎn)生，事實(shí)上，“乒乓循環(huán)機(jī)制”也可以

11、獨(dú)立發(fā)揮功能。Zuc不存在時(shí)，piRNA5端通過正常的剪切產(chǎn)生，3端通過Nbr去尾修飾(HayashiRetal.,2016)。秀麗引桿線蟲(C.elegan中不存在“乒乓循環(huán)機(jī)制”，piRNA(21U-RNAs)的產(chǎn)生于25-29nt前體，通過前體前兩個核甘酸的切除和3端修飾成熟(GuWetal.,2012)。PiRNA功能研究進(jìn)展PiRNA首先在生殖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)大量表達(dá)，其功能是抑制轉(zhuǎn)座子，維持基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。隨著體細(xì)胞和癌細(xì)胞中piRNA的發(fā)現(xiàn)，凸顯了piRNA功能的多樣性和重要性。下文就piRNA已知的幾項(xiàng)主要功能進(jìn)行闡述。IMiztminPr&gPr&gr rc3

12、5ic!riic35ic!riiFig5BiogenesisofpiRNAsbyZuc-dependentpathway轉(zhuǎn)座子剪切通過研究piRNA序列發(fā)現(xiàn)，生殖系統(tǒng)來源的極大部分piRNA是被從基因間區(qū)轉(zhuǎn)錄出來的，基因間區(qū)序列富集著大量的轉(zhuǎn)座子序列碎片(GunawardaneLSetal.,2007。PiRNA對轉(zhuǎn)座子剪切功能的實(shí)現(xiàn)主要體現(xiàn)在piRNA對反轉(zhuǎn)座子RNA進(jìn)行識別，識別后利用核酸內(nèi)切酶活性對轉(zhuǎn)座子進(jìn)行切割，達(dá)到抑制反轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座目的。生殖細(xì)胞發(fā)育過程中對反轉(zhuǎn)座子進(jìn)行調(diào)控是piRNA的主要功能之一。果蠅的卵泡細(xì)胞中，piRNA-PIWI復(fù)合物通過識別轉(zhuǎn)座子的初生轉(zhuǎn)錄本定位到轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，

13、進(jìn)而招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶對H1組蛋白進(jìn)行H3K9甲基化修飾從而抑制轉(zhuǎn)錄(HuangXAetal.,2013)。PiRNA也可以通過誘導(dǎo)DNA發(fā)生甲基化而抑制其轉(zhuǎn)座。在小鼠的精細(xì)胞中，piRNA-PIWI復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核后識別LINE-1的初生轉(zhuǎn)錄本，通過一系列反應(yīng)引起LINE-1DNA發(fā)生甲基化抑制其表達(dá)(AravinAAetal.,2008)。大量研究發(fā)現(xiàn)，piRNA在其生成過程中伴隨著在轉(zhuǎn)錄后水平上對轉(zhuǎn)座子的剪切。這一過程主要通過“乒乓循環(huán)”生成途徑完成(SaitoKetal.,2009)。表觀調(diào)控近期研究表明，piRNA途徑通過組蛋白修飾和DNA甲基化進(jìn)行表觀調(diào)控。果蠅中，PIWI和Au

14、b蛋白被發(fā)現(xiàn)是位置效應(yīng)斑(position-effectvariegation)的調(diào)控者，提示piRNA途徑通過促進(jìn)染色體的異染色質(zhì)化沉默基因表達(dá)(Pal-Bhadra,Metal.,2004。在小鼠的配子發(fā)生中， 卵母和精母細(xì)胞階段PIWI和piRNA集中高表達(dá)， 而這個階段恰是這兩種細(xì)胞處于表觀修飾最低水平的狀態(tài)，如DNA甲基化修飾、組蛋白的甲基化修飾等(SasakiHetal.,2008)。在誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSC)中也發(fā)現(xiàn)有piRNA的存在。iPSC具有分化成各類細(xì)胞的潛能，其中表觀修飾決定著細(xì)胞分化的命運(yùn)，piRNA與染色體和DNA的表觀修飾有關(guān)，通過參與這一過程，使得細(xì)胞向定向

15、的方向進(jìn)行分化(WangYetal.,2014)。除了對基因組的轉(zhuǎn)座子區(qū)域進(jìn)行表觀修飾，研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)細(xì)胞中piRNA通過DNA甲基化影響神經(jīng)突觸的可塑性(Rajasethupathy,Petal.,2012。轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控piRNA對基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控不局限于轉(zhuǎn)座子。果蠅卵巢、小鼠生殖組織、非洲爪蛙卵中發(fā)現(xiàn)一些編碼蛋白的mRNA3UTR區(qū)域同樣可以產(chǎn)生piRNA0這些3UTFE域含有轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列，提示，piRNA具有調(diào)控mRNA水平的潛能(Robine,Netal.,2009。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，piRNApathway與P-bodies緊密相連，P-bodies是一種胞質(zhì)復(fù)合物-參與翻譯調(diào)

16、控。 有研究報(bào)道，Ago3、Aub和Tud蛋白在生殖細(xì)胞中與P-bodies蛋白發(fā)生共定位(Thomson,Tetal.,2008。在小鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。Miwi和piRNA被發(fā)現(xiàn)和RNP組分相關(guān)(Grivna,STetal.,2006)。以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象揭示了PIWI-piRNA在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平可能發(fā)揮重要作用。PiRNA與癌癥研究進(jìn)展癌細(xì)胞和月中瘤組織中發(fā)生的基因變化受到一系列小分子的調(diào)控，其中包括非編碼小RNA。有研究結(jié)果表明，PIWI-piRNA與癌癥存在一定的相關(guān)性。大量研究發(fā)現(xiàn)，人類PIWI蛋白在多種腫瘤中均有異常表達(dá)，如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等(LeeJHetal.,200

17、6;ZengYetal.,2011。但是，PIWI蛋白的異常表達(dá)是如何影響月中瘤的臨床特性卻是未知的。 盡管piRNA在癌癥中還未被廣泛研究， 但是僅有的少數(shù)研究表明，癌癥中piRNA表達(dá)譜發(fā)生了變化。乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個特異的piRNA序列，其中差異表達(dá)的有6個。 采用RT-PCR技術(shù)在大樣本中驗(yàn)證， 證實(shí)其中4個確實(shí)發(fā)生了顯著性變化(HuangGetal.,2013)。有報(bào)道表明，piR-823在胃癌組織中表達(dá)顯著降低，并且表達(dá)水平與胃癌分期相關(guān)，piR-823水平上調(diào)會導(dǎo)致胃癌細(xì)胞生長抑制(ChengJetal.,2011)此外， 胃癌患者外周血中piR-823明顯低于對照組，說明piR

18、-823具有作為胃癌診斷標(biāo)志物的潛能。PiR-823也被證明和多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)。有研究表明piR-823在多發(fā)性骨髓瘤中顯著上調(diào)并與臨床分期呈正相關(guān)。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞沉默piR-823誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，piR-823通過表觀修飾抑制抑癌基因的表達(dá)(YanHetal.,2015)。piR651被發(fā)現(xiàn)也和胃癌相關(guān)。在胃癌組織中，piR651表達(dá)上調(diào)，上調(diào)水平也與胃癌分期相關(guān)。可作為胃癌診斷治療的潛在靶點(diǎn)(ChengJ,etal.,2011)。piRNA在月中瘤中異常表達(dá)的現(xiàn)象已多有報(bào)道，但有關(guān)piRNA調(diào)控月中瘤進(jìn)展的機(jī)制研究較少。部分學(xué)者，根據(jù)piRNA

19、在生殖系統(tǒng)中的研究結(jié)果對其在月中瘤中的機(jī)制進(jìn)行了假設(shè)：(1)piRNA通過甲基化修飾的表觀調(diào)節(jié)參與到月中瘤的形成中；(2)piRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對編碼蛋白的月中瘤相關(guān)mRNA進(jìn)行降解；(3)piRNA與miRNA均為非編碼小RNA,可能也具有與miRNA相似的作用。目前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，piRNA在月中瘤中發(fā)揮作用的機(jī)制主要有兩種形式： 表觀調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控。DNA甲基化異常、異染色質(zhì)H3K9me3修飾及轉(zhuǎn)座被發(fā)現(xiàn)參與到月中瘤進(jìn)展中。人類淋巴瘤和乳腺癌細(xì)胞系中， 單拷貝piRNA通過不完全結(jié)合到非轉(zhuǎn)座子的靶標(biāo)CpGs的基因組DNA上進(jìn)行基因特異性的DNA甲基化修飾(Fu,Aetal.,2014

20、)。進(jìn)一步研究：使用帶有rs1326306SNP的piR-021285突變體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)，ARHGAP11A基因的第一個外顯子的CpG島甲基化水平顯著降低。 與轉(zhuǎn)染野生型piRNA的細(xì)胞相比，piR-021285突變體增強(qiáng)了ARHGAP11A基因表達(dá)，因此癌細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)(Fu,Aetal.,2015)。果蠅中，PiRNA還可以通過上調(diào)亞端粒異染色質(zhì)區(qū)域H3K4me3和抑制H3K27me3誘導(dǎo)常染色質(zhì)狀態(tài)來激活基因表達(dá)(Yin,Hetal.,2007)。與這種機(jī)制相類似，類piRNA分子，位于生長抑制特異性基因(GrowthArrestSpecific5,GAS5)內(nèi)含子區(qū)域,與P

21、IWIL1/4一起招募hCMPASS類似復(fù)合物到月中瘤壞死因子家族TRALL的啟動子區(qū)域從而激活TRLL的表達(dá)，抑制月中瘤生長(He,Xetal.,2015)。除了表觀修飾，PiRNA也可以對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。 在人類支氣管上皮細(xì)胞系中敲除piR-L-163后，DNA合成加速，G2-M期轉(zhuǎn)換加速，加快了細(xì)胞的侵襲和遷移能力(He,Xetal.,2015)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，piRNA-L-163與磷酸化的蛋白質(zhì)ERM的結(jié)合是其發(fā)揮作用的重要形式，提示，piRNA在肺癌中的功能性作用。上述結(jié)果表明，piRNA在月中瘤中發(fā)揮功能性作用也可以以PIWI非依賴的形式進(jìn)行。參考文獻(xiàn)Andersen,P.R

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