PCR污染原因與檢測(cè)方法

1、PCR污染原因與檢測(cè)方法PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性， 但令人頭痛的問(wèn)題是易污染， 極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因一、標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。二、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中最主要最常見(jiàn)的污染問(wèn)題。因?yàn)镻CR產(chǎn)

2、物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml）,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極彳量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。四、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由

3、于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染,以便采取措施，防止和消除污染。對(duì)照試驗(yàn)一、陽(yáng)性對(duì)照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高（100個(gè)拷貝以下）。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，

4、在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。二、陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括：1 .標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。2.試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。三、重復(fù)性試驗(yàn)。四、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。防止污染的方法一、污染的預(yù)防進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。1.劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，P

5、CR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：(1)標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備。(2)擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。(4)各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專(zhuān)用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備fPCR擴(kuò)增-產(chǎn)物分析-產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。2 .分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。 所有的加樣器和吸頭需固定放于其中， 不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來(lái)源的DNA:(1)PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水。(2)引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)

6、配制。(3)引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因3.實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。(2)使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。(3)避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。(4)操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dN

7、TP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。(5)最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。(6)操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。(7)盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器， 由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)。(8)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論二、追蹤污染源如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。1.設(shè)立

8、陰陽(yáng)性對(duì)照：有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照，100個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重，因?yàn)镻CR敏感性極高，可以從其它方法(Sourthern印跡或點(diǎn)雜交等)檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。止匕外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA,這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí)，要全部更

9、換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測(cè)試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。2.環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見(jiàn)的污染源主要有：(1)模板提取時(shí)真空抽干裝置。(2)凝膠電泳加樣器。(3)電泳裝置。(4)紫外分析儀。(5)切膠用刀或手術(shù)刀片。(6)離心機(jī)。(7)冰箱門(mén)把手，冷凍架，門(mén)把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等。此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來(lái)查找可疑污染源：(a)用無(wú)菌水浸泡過(guò)的滅菌棉簽擦拭可疑污染源。(b)0.1ml去離子水浸泡。(c)取5ml做PCR實(shí)驗(yàn)。(d)電泳檢測(cè)結(jié)果。(8)氣溶膠。

10、如果經(jīng)過(guò)上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，若條件不允許，則重新設(shè)計(jì)新的引物(與原引物無(wú)相關(guān)性)。三、污染處理1 .環(huán)境污染(1)稀酸處理法： 又t可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡， 使殘余DNA脫喋吟紫外照射(UV)法：紫外波長(zhǎng)(nm)一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。UV照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中喀呢堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA

11、鏈中所有喀呢均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長(zhǎng)，喀呢二聚體的類(lèi)型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核甘酸的序列。 在受照射的長(zhǎng)DNA鏈上， 形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷(如環(huán)丁烷型喀呢復(fù)合體，胸腺喀呢乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等)均可終止TaqDNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)(0.13/堿基)在DNA分子上隨機(jī)分布，一個(gè)500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn)，那么，105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個(gè)拷貝分子

12、中將有許多分子沒(méi)有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。2 .反應(yīng)液污染可采用下列方法之一處理:(1)DNaseI法：PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5UDNaseI,室溫反應(yīng)30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列。(2)內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶(如MspI和TaqI等)，可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進(jìn)行PCR。(3)紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法。g射線輻射法：1.5kGy的輻

13、射可完全破壞0.1ng基因組DNA,2.0kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0kGy仍不影響PCR,但高于此限度會(huì)使PCR擴(kuò)增效率下降。 引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過(guò)水的離子化產(chǎn)生自由基來(lái)破壞DNA的。3 .尿喀呢糖甘酶(UNG)法由于UV照射的去污染作用對(duì)500bp以下的片段效果不好， 而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。原理： 在PCR產(chǎn)物或引物中用dU代替dT.這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育， 因UDG可裂解尿喀呢堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力

14、。UNG對(duì)不含dU的模板無(wú)任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿喀噬，而對(duì)RNA中的尿喀噬和單一尿喀噬分子則無(wú)任何作用。(2)dUTP法：用dUTP代替dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量dU.在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。(3)dU引物法：合成引物時(shí)以dU代dT,這樣PCR產(chǎn)物中僅5/端帶dU.UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長(zhǎng)片段(1-2kb以上)的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點(diǎn)。dU引物最好將dU設(shè)計(jì)在3/端或近/端。該

15、法僅能用于引物以外試劑的處理。優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來(lái)源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。(5)需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-(UNG缺陷)大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG消化掉。4 .周相捕獲法用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：(1)用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)。(2)用包被鏈霉親和素的周相載體來(lái)捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過(guò)漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)(3)洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第(2)步的漂洗后可用PCR檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。5 .RS-PCR法(RNA-specificPCR)也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽(yáng)性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3/端(A區(qū))有20個(gè)核甘酸左右為模板的特異性互不序列，5/端20個(gè)核甘酸(C區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使cDNA與多余引物分開(kāi)， 再用和第二引