Western-Blotting實驗報告

1、Western Blotting本次試驗的目的是使同學們掌握 Wester n Blott ing法鑒定目標蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗體結(jié)合反響的影響因素。Western Blotting的blotting 譯為印跡法，是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上， 而后利用相應的探測反響來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜NC膜上，并利用DNA RNA雜交檢測特定的 DNA片段的方法，稱為 Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進展印跡分析，對 RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電

2、泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為 Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子 的印跡分析稱為Eastern印跡法。Western既可以定性，又可以半定量，是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。它通常分為兩種方法：Wester n Blotti ng方法一：直接法方法二：間接法優(yōu)點：1. 快速一種抗體2. 沒有二抗交叉反響引起的非特異性條帶1. 免特異性不受標記影響2. 信號放大火敏度高多 個二抗結(jié)合位點3. 多種標記的二抗可供 選擇4.可選擇不同的 Marker缺點：1.免疫反響性降低1.交叉反響引起的非特2.無信號二級放大異性條帶3.抗體標記費時昂貴，使2.額外的二抗孵育以與用不方便條件優(yōu)

3、化同時Western又具有多種識別蛋白質(zhì)的顯色方法，主要有以下幾種：i.放 射自顯影ii.底物化學發(fā)光ECL iii.底物熒光ECF iv.底物DAB呈色現(xiàn)常 用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色。一、實驗原理Wester n Blott ing蛋白質(zhì)免疫印跡法是將經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳奮力的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜上，固相載體以非共價 鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳別離的多肽類型與其生物學活性不變。以固相 載體上的蛋白質(zhì)為抗原，與之對應的第一抗體發(fā)生免疫結(jié)合反響，一抗再與酶或同位素標記的第二抗體發(fā)生免疫結(jié)合反響，經(jīng)過底物顯色活放射自顯影以檢查電泳別離的提議目的蛋白成分。

4、蛋白質(zhì)印跡技術結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免 疫測定特異性高、敏感等諸多優(yōu)點，能從復雜混合物中對特定抗原進展鑒別和定 量檢測。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)和催 化劑(AP)、加速劑(TEMED聚合成的三維網(wǎng)孔結(jié)構(凝膠。據(jù)有無濃縮效應可將 電泳分為兩類：i. 連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液pH值、凝膠濃度一樣，帶電粒子靠電荷與分子篩效應區(qū)分。ii.不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖離子成分、pH值、凝膠濃度不同，帶電粒子在電場中由電效應、 分子篩效應、濃縮效應區(qū)分。SDS-PAGE的原理是：依靠SDS帶有大量負電荷來掩蓋蛋白質(zhì)外表的凈 電荷：同時由于在電泳溶液中參加了 SDS和巰

5、基乙醇，因此它還可以改變蛋白 質(zhì)構象：在實驗中要注意：印跡法需要較好的蛋白質(zhì)凝膠電泳技術，是蛋白質(zhì)樣品達到良好的別離效果，而且要注意膠的質(zhì)量，是蛋白質(zhì)容易轉(zhuǎn)移帶固相支持物上， 另外蛋白質(zhì)在電泳過程中別離得到的條帶被保存在膜上，在隨后的寶物階段不丟失和擴散。免疫印跡分析之需要很小體積的時間，較短的時間過長，操作容易， 適用于理論和應用上的研究。本實驗采用人血清為材料，人類Ig根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構和抗原特異性的不同，分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中IgG占血清免疫球蛋白總量的75%80%。人的IgG由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，它們之間以二 硫鍵相連。在加SDS的電泳條件下

6、，分子中的二硫鍵被復原成游離的巰基，四 條鏈分開，重鏈遷移速度較慢，輕鏈遷移速度較快，可跑出兩條帶。對此樣品進 展SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE丨后，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝 酸纖維素薄膜上，用兔抗人IgG為第一抗體，用辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG 為第二抗體，在過氧化物酶第五存在的情況下，檢測人的IgG。二、試劑，器材和實驗材料【試劑】1. 30 %丙烯酰胺貯備液：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加重蒸水至 100ml 。2. 濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCI , pH6.8。3. 別離膠緩沖液：3moI/L Tris-HCI , pH8.9 。4.

7、 10 %過硫酸銨(w/v):臨用前用蒸餾水配制。5. 10 % SDS(w/v)。6. 10 %TEMED。7. 電極緩沖液：甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至 800ml , pH8.3。8. 樣品緩沖液：0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH6.8 , 20 %甘油,4 % SDS, 10 % 巰基乙醇，0.005 %溴酚蘭。9. 考馬斯亮藍R250染色液：考馬斯亮藍 R250 0.25g , 30%乙醇，10%冰乙 酸。10. 脫色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。11. TBSTris-HCI,NaCI 丨緩沖液：20mmo

8、l/L Tris-HCl,12. 500mmoI/L NaCI , pH7.5，每組配 150ml。13. TTBS: 取 100mITBS，力卩 250 山 20 % Tween-20。14. 封閉液與抗體稀釋液：3 %脫脂奶粉-TBS，每組配10ml。15. 底物溶液：2.5mg二氨基聯(lián)苯胺DAB+ 10mITBS +10 pl H2O2，臨用 前配制。16. 考馬斯亮藍R250染色液：考馬斯亮藍 R250 0.25g , 30%乙醇，10%冰乙 酸，總體積500ml。17. 脫色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml?！酒鞑摹?. 夾心式電泳槽2. 轉(zhuǎn)移電泳槽3. 電泳儀【實驗材料

9、】1. 人血清2. 硝酸纖維素膜三、實驗步驟I SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1. 灌膠前的準備：將兩塊玻璃板洗凈晾干或用吹風機吹干，嵌入本體的 凹槽中，長玻板朝外，短玻板朝，兩塊玻璃板之間就形成了凝膠室。合上滑 塊，擰螺栓鎖緊凝膠室，檢查凝膠室底部是否與本體底端重合。然后將以上 組合放入制膠架，插入并旋轉(zhuǎn)凸輪，即可灌膠。2. 配制膠液膠液濃度%別離膠濃縮膠12%4%30%貯備液(ml)3.20.53別離膠緩沖液(ml)2一濃縮膠緩沖液(ml)一1.0重蒸水(ml)2.662.3610%SDS(ul)8040混勻后再參加以下試劑：10%TEMED(ul)804010 %過硫酸銨(ul)4020總體積

10、(ml)843. 灌 膠：將配制好的別離膠液倒入兩塊玻璃板之間的凝膠室中，待膠液加至距短玻璃板 頂端約1.5cm處時停止灌膠，然后在膠液外表上小心參 加厚約0.5cm的水層，以保持別離膠面平整，同時隔絕空氣，空氣中的氧 對凝膠的聚合有阻礙作用。待凝膠和水之間出現(xiàn)清晰界面時，說明別離膠已 聚合，大約30min完成聚合。傾去別離膠上層的水，將配制好的濃縮膠液 加到別離膠上，至接近短玻璃板的頂端，插上樣品梳，放置待其聚合。4. 配制電極緩沖液:甘氨酸14.1g , SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml， pH8.3。每組配 1000ml。5. 制 樣：5山人血清，加45訕水，再加50

11、山加樣緩沖液。沸水浴加熱8 分鐘，10000rpm 離心2分鐘,取上清液作為樣品。另按說明書制備好蛋白 質(zhì)分子量標準樣品。6. 力口 樣：1、參加電極緩沖液；a) 拔出樣品梳；b選3個樣品槽，用微量進樣器加樣，中間槽參加 5訕分子量標準蛋 白樣品，兩旁槽各參加10 d人血清樣品。 穩(wěn)壓120V電泳，當溴酚藍 前沿到達距底部0.5cm左右時，停止電泳。7. 切膠：根據(jù)切割線，先豎切后橫切，寬膠條為兩泳道，含人血清樣和分子 量標準蛋白樣，考馬斯亮藍 R-250全蛋白染色。窄膠條為一泳道，為人血 清樣，轉(zhuǎn)印后對目標蛋白免疫染色。8. 膠條保存：將兩個膠條用保鮮袋包好，貼上標有自己名字的標簽-20 C

12、凍 存。n轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上1. 將帶有人血清和標準蛋白的寬膠帶用考馬斯亮藍 R250染色、脫色：將寬膠 條放到培養(yǎng)皿中，用蒸餾水清洗后，參加約10ml考馬斯亮藍R-250染色液 染色1小時左右，然后換成脫色液脫色，不時搖動。更換幾次脫色液，至背 景無色透明，條帶清晰為止。2. 放置NC膜和膠條：a.切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜，用轉(zhuǎn)移緩沖液或水浸泡5min使之濕潤。b.準備2濾紙和海綿一起浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。c翻開轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移槽的膠板，依次放入：a. 一浸濕的海綿b. 一浸濕的濾紙c.用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗過的膠，并小心地趕走濾紙和膠之間的氣泡d.硝酸纖維素膜，在膜的右下角剪一小角，以標明電

13、泳方向e. 一浸濕的濾 紙f. 一浸濕的海綿。3. 轉(zhuǎn) 移：小心地合上膠板，按膠側(cè)為負極，膜側(cè)為正極的方向放入轉(zhuǎn)移電泳 槽中，加轉(zhuǎn)移緩沖液至滿。插好轉(zhuǎn)移電泳裝置的電極，翻開電泳儀開關調(diào)至 穩(wěn)壓60V ,電泳1h，轉(zhuǎn)移完畢后翻開膠板取出硝酸纖維素薄膜。川膜的酶聯(lián)免疫染色1. 封閉：用TBS緩沖液洗膜1min后，將膜封入塑料薄膜袋，留一開口。加封 閉液1ml后封閉開口，37 C搖床上搖動30min 。2. 加封閉液與抗體a) 與第一抗體結(jié)合(1)棄封閉液，參加適當稀釋的1ml第一抗體溶液(兔抗人IgG)，封口 后37 T搖床上輕輕搖動50min。 取出膜，用TTBS洗膜3 次,每次1min。再封入

14、一新的塑料薄膜袋。b) 與酶標第二抗體結(jié)合(3) 參加適當稀釋的1ml辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，37 °C搖床上輕輕搖動50min。(4) 取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次， 以去除Tween-20 。加底物溶液顯色將膜浸入10ml底物溶液中，至顯色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。轉(zhuǎn)入水中保存。3. 結(jié)果分析：在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相，并分析結(jié)果。測量分子量標準蛋白 的遷移距離，作出標準曲線，再測出硝酸纖維素膜上的人IgG帶的遷移距離， 在標準曲線上查出人IgG重鏈的分子量。實驗結(jié)果:做標準蛋白曲線的的凝膠的總長為7.53cm條帶1條帶2條帶3

15、條帶4條帶5條帶6蛋白條帶標準分子量66.245.035.25.018.414.4Mr/KDa0logMr1.821.651.51.401.261.164蛋白質(zhì)條帶遷移距離/cm1.582.413.14.185.155.827相對遷移率0.210.320.40.560. 680.772帶有人血清IgG的硝酸纖維素膜的總長為7.24cmIgG輕鏈遷移距IgG輕鏈相對IgG重鏈遷移距IgG重鏈相對離/cm遷移率離/ cm遷移率數(shù)值4.080.562.380.33raD量子分數(shù)對標準蛋白所作標準曲線y = -1.1451X + 2.0366系列1線性系列155 Oa0.20.40.60.81相對遷移

16、率Mr由公式 y = -1.1451X + 2.0366 知：當x重鏈相對遷移率=0.33時，y=1.6587 得IgG重鏈相當分子量為：45.57KDa當x輕鏈相對遷移率=0.56時，y=1.3953 得IgG輕鏈相當分子量為：24.85KDa討論：一、實驗本卷須知：1. 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有神經(jīng)毒性， 注意不要沾在皮膚上，如有沾染可 用水洗凈。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。2. 電泳槽只能用水沖洗，不能用刷子刷，以免刷斷鉑電極絲；注意保護玻璃板。3. 一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結(jié)合抗原能力較且易發(fā)生強、靈敏度高，但易產(chǎn)生非特異性的背景；單克隆抗體識別抗原特異性

17、較好， 但可能不識別在樣品制備時因變性而失去了空間構型的抗原表位，交叉反響。因此，兼有多克隆抗體和單克隆抗體優(yōu)點的混合單克隆抗體近年特別被推薦，它是由一組能與抗原分子中的不同且不易變性的抗原表位結(jié)合 并不易出現(xiàn)交叉反響的單克隆抗體混合構成。4. 如果反響靈敏度不高，可增加凝膠的厚度到1.5mm厚度超過2.0mm時, 凝膠轉(zhuǎn)移效率受限；也可在電泳條帶不發(fā)生變形的前提下，盡量提高蛋白樣品的上樣量。5. 濾紙/凝膠/轉(zhuǎn)印膜/濾紙夾層組合中不能存在氣泡，可用玻璃棒在夾層組合上 滾動將氣泡趕出，以提高轉(zhuǎn)膜效率；上下兩層濾紙不能過大，防止導致直接 接觸而引起短路。6. 如果出現(xiàn)非特異性的高背景，可觀察僅用

18、二抗單獨處理轉(zhuǎn)印膜所產(chǎn)生的背景 強度，假設高背景確由二抗產(chǎn)生，可適當降低二抗?jié)舛然蚩s短二抗孵育時間； 并考慮延長每一步的清洗時間。7. 一抗與二抗的稀釋度、作用時間和溫度對檢測不同的蛋白要求不同，須經(jīng)預 實驗確定最正確條件。8. 一般情況使用0.45 ym的NC膜，0.10.2 ym的小孔徑膜只適合于分子量 小于20kD的蛋白質(zhì)。二、實驗思考題：1. 12%的別離膠適合別離多少分子量圍的蛋白質(zhì)？答：由?分子克隆?中的別離膠濃度與蛋白質(zhì)分子量線性關系圖知，12%的別離膠適合別離分子量圍在15-60KDa的蛋白質(zhì)。2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用？答：SDS-PAGE中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸, 電