Real-time PCR實驗原理與技術(shù)

1、胡曉研究生實驗技術(shù)2015-12-7qRT-PCR技術(shù)原理一一、實驗原理：、實驗原理：在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 反應(yīng)進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。 熒光信號 + 標準曲線定量分析？qRT-PCR技術(shù)原理a)Ct值(Cycle Threshold;每個反應(yīng)管中熒光強度達到閾值所需的循環(huán)數(shù))與樣本初始拷貝數(shù)存在正比線性關(guān)系。b)以不同稀釋倍數(shù)的已知模板制備標準曲線。c)實時監(jiān)測未知樣本的Ct值，對應(yīng)標準曲線得到未知樣本的初始拷貝數(shù)。（定量分析）qRT-PCR技術(shù)熒光標記方法的分類1.非特異性的非特異性的DNA結(jié)合染料法：結(jié)合染

2、料法：熒光染料能非特異結(jié)合DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中，而游離的熒光染料不發(fā)出熒光。 常用染料：Pico Green （靈敏度高,=25pg/mL） SYBR I 缺點：易受到非特異性擴增和引物二聚體的影響。 措施：設(shè)計特異性引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。 qRT-PCR技術(shù)熒光標記方法的分類qRT-PCR技術(shù)熒光標記方法的分類2.特異性熒光定量特異性熒光定量PCR:以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)水解探針法分子信標Scorpion引物/探針復(fù)合探針qRT-PCR技術(shù)影響因素樣品RNA 的完整性RNA 樣品中的基因組 DNA污染特異性良好的引物PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化反轉(zhuǎn)錄所得 cDNA 的量必須精確地等于相

3、應(yīng)的mRNA的量可靠的內(nèi)標基因： TEF-2qRT-PCR技術(shù)實驗操作技術(shù)實驗操作qRT-PCR技術(shù)實驗操作陽性陽性模板模板qRT-PCR技術(shù)實驗操作1.制作標準品陽性對照：測定陽性模板的濃度，10倍稀釋為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。2.反應(yīng)體系如下:(標準品反應(yīng)體系標準品反應(yīng)體系)序號序號 反應(yīng)物反應(yīng)物 劑量劑量 1SYBR Green 1 染料 10l 2陽性模板上游引物F 0.5l 3陽性模板下游引物R 0.5l 4dNTP 0.5l 5Taq酶 1l6陽性模板DNA 5l 7 ddH2O 32.5l 總總體積體積 50l3. 輕彈管底將溶

4、液混合，短暫離心。(內(nèi)參照基因內(nèi)參照基因反應(yīng)反應(yīng)體系體系) 序號序號 反應(yīng)物反應(yīng)物 劑量劑量 1 SYBR Green 1 染料 10l 2內(nèi)參照上游引物F 0.5l 3內(nèi)參照下游引物R 0.5l 4dNTP 0.5l 5Taq酶 1l 6待測樣品cDNA 5l 7ddH2O 32.5l 總總體積體積 50lqRT-PCR技術(shù)實驗操作1、 制備用于繪制制備用于繪制梯度稀釋標準曲線梯度稀釋標準曲線的的DNA模板模板： 針對每一每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)。 序號 反應(yīng)物 劑量 1 10 PCR緩沖液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul 3 上游

5、引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8ddH2O 9 至25ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 35個PCR循環(huán)（941分鐘；551分鐘；721分鐘）;72C延伸5分鐘。 PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。 將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為11010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。qRT-PCR技術(shù)實驗操作待測樣品的

6、待測基因?qū)崟r定量待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR:所有cDNA樣品分別配臵實時定量 PCR反應(yīng)體系。 體系配臵如下：序號 反應(yīng)物 劑量1SYBR Green 1 染料 10 ul2上游引物 1ul 3下游引物 1ul 4dNTP 1ul 5Taq聚合酶 2ul 6待測樣品cDNA 5ul 7ddH2O 30ul 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。qRT-PCR技術(shù)實驗操作上機前樣本的制備上機前樣本的制備檢測程序的設(shè)置檢測程序的設(shè)置檢測孔及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置檢測孔及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)置熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)置運行檢測程序運行檢測程序結(jié)果的顯示與輸出結(jié)果的顯示與輸出結(jié)果

7、分析結(jié)果分析熔解曲線熔解曲線擴增曲線擴增曲線qRT-PCR技術(shù)實驗操作qRT-PCR技術(shù)實驗操作（優(yōu)化）qRT-PCR技術(shù)實驗操作（優(yōu)化）qRT-PCR技術(shù)實驗操作（優(yōu)化）假陽性：熒光染料能和任何假陽性：熒光染料能和任何 ds DNA 結(jié)合，因此它也能與結(jié)合，因此它也能與非特異的非特異的雙鏈雙鏈如如引物二聚體引物二聚體或或非特異性擴增產(chǎn)物非特異性擴增產(chǎn)物等結(jié)合。等結(jié)合。要避免這些非特異熒光信號對定量精確性的影響，可以利用熱循環(huán)儀內(nèi)設(shè)定的熔解反應(yīng)程序?qū)U增產(chǎn)物進行熔解曲熔解曲線分析。線分析。熔解曲線峰為熔解曲線峰為單一峰形，未單一峰形，未見其他峰值，見其他峰值，并且峰的形狀并且峰的形狀也比較銳利

8、。也比較銳利。擴增產(chǎn)物特異擴增產(chǎn)物特異性好。性好。qRT-PCR技術(shù)實驗操作（優(yōu)化）有研究建議在每一個循環(huán)中 PCR 延伸后增加一步，即將溫度提高后再檢測反應(yīng)體系中的熒光。該檢測溫度大于引物二聚體的退火溫度 Tm，而小于特異性擴增產(chǎn)物的 Tm值。在此溫度下，引物二聚體都變性成單鏈，因此只檢測到與特異性 PCR 產(chǎn)物結(jié)合的 SYBR Green I 所發(fā)出的熒光，消除了引物二聚體的干擾，降低了非特異性熒光，有助于目標基因的準確定量。qRT-PCR技術(shù)實驗操作（優(yōu)化）標準品的選擇： 理論上可以以目的基因的PCR擴增產(chǎn)物為標準品，但是存在降解、污染等因素影響定量結(jié)果。論壇網(wǎng)友給出了幾種解決方法：另設(shè)計一對引物用于熒光PCR；將擴增序列插入T載體后作為標準品；設(shè)計一對外圍引物擴增PCR,將產(chǎn)物連入T載體(+)qRT-PCR技術(shù)實驗操作（優(yōu)化）1、同管擴增：減少操作誤差，引物間影響大、同管擴增：減少操作誤差，引物間影響大2、異管擴增：擴增結(jié)果真實可信，具有操作誤差、異管擴增：擴增結(jié)果真實可信，具有操作誤差1.總RNA提?。?.模板cDNA制作；3.半定量PT-PCR：1.引物設(shè)計及選擇：引物設(shè)計及選擇：a)上下游引物設(shè)計在跨內(nèi)含子的一個外顯子的5端和下一個外顯子的3端。b)設(shè)計在兩個離得遠的外顯子上。2.引物的長度：引物的長度：嚴格