原卟啉鈉體內(nèi)外抗乙肝病毒作用研究

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減原嚇咻鈉體內(nèi)外抗乙肝病毒作用研究（作者：單位：郵編：）【摘要】目的觀察原嚇咻鈉體內(nèi)外抗乙肝病毒作用。方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用先天感染鴨乙肝模型，檢測給藥前、給藥后5d、10天及停藥后3d鴨血清DHBV-DNA的動態(tài)變化；體外實(shí)驗(yàn)采用2215細(xì)胞為模型，檢測用藥后對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用。結(jié)果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，給藥第5,10d時鴨血清DHBV-DNA其0D值均明顯低于給藥前，差異有顯著性意義（P0.05）；體外實(shí)驗(yàn)顯示，原嚇咻鈉在所稀釋的各濃度下，對細(xì)胞分泌HBsAg,HBeAg均有一定的抑制作用，對HBsAg,HBeAg的治療指數(shù)分別大于188

2、.7和64.5。結(jié)論原嚇琳鈉體內(nèi)外均具有明顯的抗乙肝病毒作用?！娟P(guān)鍵詞】原嚇琳鈉鴨乙型肝炎病毒2215細(xì)胞株Abstract:ObjectiveToobservetheinhibitoryeffectofNAPPonHepatitisBvirusinvitroandinvivo.MethodsDuckmodelofcongenitalinfectionofHBVwasusedintheinvivotest.DHBV-DNAinserumwasdetectedbydot-hybridizationtestbeforetreatment,5daysand10daysaftertreatment.T

3、hecell2215linewastakenascellmodel.TheinhibitoryeffectofNAPPonHBsAgandHBeAgsecretedby2.2.15cellswasevaluatedwithELISAmethod.Resultslntheanimalmodel,theopticdensityvalueofDHBV-DNAinduckserumwasreducedmarkedlyaftertreatmentwithNAPPfor5daysand10days,therewasremarkabledifference(P0.05).Inthecellmodel,NAP

4、PhadobviousinhibitoryeffectonHBsAgandHBeAgindifferentconcentrations.ThetherapeuticindexofNAPPwasgreaterthan188.7forHBsAgand64.5forHBeAg.ConclusionNAPPhasacertaininhibitoryeffectonHepatitisBvirusinvitroandinvivo.KeywordsProtoporphyrindisodium(NAPPP);DuckhepatitisvirusB;2.2.15cellculture抗病毒治療目前是治療乙型病毒

5、性肝炎的關(guān)鍵，而現(xiàn)有的抗病毒藥物多數(shù)具有治療后長期應(yīng)答率不夠理想以及較多的副作用等問題，所以尋找新的、高效低毒抗乙肝病毒藥物就顯得尤為重要，原口卜咻鈉分子式C34H32N4O4Na2,化學(xué)名為1,3,5,8-四甲基-2,4二乙烯基嚇吩-6,7-二丙酸鈉(ProtoporphyrinDisodiumNAPP),是由四個毗咯環(huán)經(jīng)四個次甲基鍵連接而成的含共扼雙鍵的大環(huán)化合物，可由血紅蛋白的輔基血紅素經(jīng)人工提取、加工而成的。近年來有研究報道，NAPP體外具有抗乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)的作用1。為了進(jìn)一步明確其抗病毒效果，本研究對NAPP體內(nèi)外抗HBV作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。現(xiàn)

6、報道如下。1材料1.1藥物原嚇咻鈉(NAPP),本實(shí)驗(yàn)室提取，純度94.1%;拉米夫定葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20030581o1.2 動物1日齡龍巖麻鴨35只，雄性，體重(50±5)g,購自石井潮陽村孵化場，常規(guī)飼養(yǎng)。飼料：寶鼎501小鴨飼料，由穗屏企業(yè)有限公司飼料廠生產(chǎn)。1.3 試齊缺口翻譯平移試劑盒購自美國PromegaCO公司；a-32P-dCTP購自北京市亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司；NC膜購自Amersham公司；DHBV質(zhì)粒由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶病研究所病毒室保存；SephadexG-50購自Pharmacia公司；MEM干粉、胎牛血清購自G舊CO

7、公司；HBsAg,HBeAg抗原檢測試劑盒購自上?？迫A生物工程公司；MTT檢測試劑盒購自北京碧云天公司；PCR試劑盒購自華美生物工程公司。1.4 HepG2.2.15細(xì)胞引自上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病毒實(shí)驗(yàn)室。2方法2.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1.4.1 動物的分組及給藥方法1日齡龍巖麻鴨購回后喂養(yǎng)2d后，自脛靜脈取血，離心，收集血清，用斑點(diǎn)雜交的方法檢測DHBV-DNA,第13天出結(jié)果，篩選出先天自然感染鴨后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將DHBV-DNA陽性鴨隨機(jī)分為3組：模型組、拉米夫定組和NAPP組，每組8只。NAPP組和拉米夫定組每天按20mg/(kg)劑量口服給藥，模型組以生理鹽水代替藥物，連續(xù)給藥10do分別

8、于給藥前、給藥后5d、給藥后10d及停藥后第3天采集血樣，分離血清，-70C凍存待檢。2.1.2鴨血清DHBV-DNA的檢測采用DHBV-DNADotBlot法測定2。取上述鴨血清，每批同時點(diǎn)膜，測定鴨血清中DHBV-DNA水平，觀察其動態(tài)變化。按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，將40“血清點(diǎn)于硝酸纖維膜上，然后雜交，放射自顯影，在酶標(biāo)檢測儀上測定OD值（濾光片波長為490nm）。2.2體外實(shí)驗(yàn)2.2.1 細(xì)胞毒性檢測根據(jù)Mosmann等建立的四甲基偶氮嗖鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測藥物細(xì)胞毒性。具體方法：用胰酶消化HepG2.2.15細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2

9、X104cell/ml,加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100訕，每個濃度設(shè)3孔，培養(yǎng)24d,吸去上清后加入含有不同濃度藥物（1,10-1,10-2,10-3,10-4mg/ml）的DMEM培養(yǎng)基。作用72d之后，各孔中加入10訕的MTT并繼續(xù)培養(yǎng)4h,去上清，每孔加入100訕DMSO,輕輕振蕩使甲腹溶解，測570nm波長下吸光度的OD值。計(jì)算細(xì)胞存活率和各種藥物的半數(shù)毒性濃度TC50,TC50是實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞為對照組的50%時的藥物濃度。細(xì)胞存活率（）=（OD實(shí)驗(yàn)孔一OD空白對照）/（OD細(xì)胞對照一OD空白對照）X1OO%,TC50=Antilog:B+（50-50%破壞百分率）XC/（50%破壞百

10、分率-50%破壞百分率）C=A-B,A=Iog50%藥物濃度B=log50%藥物濃度2.2.2 藥物對細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg抑制作用HepG2.2.15細(xì)胞胰酶消化后，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1ml,培養(yǎng)4d后換用含藥培養(yǎng)液，并設(shè)拉米夫定為陽性對照組。根據(jù)藥物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定藥物的濃度，每濃度加3孑L,同時設(shè)不加藥細(xì)胞對照3孔及培養(yǎng)液空白對照3孔，并于第3,6天更換新鮮的含藥液培養(yǎng)，第9天收集各孔細(xì)胞上清液，-20C冷凍。采用ELISA法檢測上清液中HBsAg,HBeAgo藥物對抗原的抑制百分率（）=（OD細(xì)胞對照一OD實(shí)驗(yàn)孔）/（OD細(xì)胞對照一OD空白對照）X100%,IC50為

11、HBsAg,HBeAg抑制率為50%時的藥物濃度。治療指數(shù)TI二TC50/IC50o2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理F分析配對t檢驗(yàn)采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3結(jié)果3.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組用藥后不同時間光密度值與同組給藥前光密度值的比較。（見表1）。NAPP組在給藥后第5天鴨血清DHBV-DNA水平有較明顯下降，與給藥前自身比較，差異有顯著性（P0.05）,第10天與給藥前自身比較，差異有顯著性意義（P0.01）。拉米夫定組在給藥后第5天DHBV-DNA水平明顯下降，與給藥前自身比較，差異有顯著性意義（P0.01）。表1NAPP對鴨乙肝模型血清病毒滴度的抑制作用（略）3.2 體外實(shí)驗(yàn)NAPP對H

12、epG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用見表2s3。由表2可知，NAPP和拉米夫定的各濃度組與細(xì)胞對照組相比HBsAg,HBeAg的0D值差異均有顯著性（P0.05）oNAPP的各劑量組之間HBsAg,HBeAg的OD值差異有顯著性（P0.05）。NAPP組各濃度與拉米夫定組各濃度相比，對HBsAg,HBeAg抑制差異無顯著性（P0.05）。表2藥物對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg,HBeAg的抑制作用（略）表3NAPP和拉米夫定對HBsAg,HBeAg的治療指數(shù)藥物TC50（略）用TI來評價NAPP的抗HBV效果。當(dāng)TI2時，受試藥物高效低毒，TI越大，則表明該藥對

13、HBV的抑制作用越強(qiáng)，細(xì)胞毒越小3。由表3可知，NAPP對HBsAg,HBeAg的治療指數(shù)分別大于188.7和64.5,提示對HBsAg,HBeAg的分泌均有抑制作用且毒性低。4討論由于鴨乙肝病毒生物學(xué)特性及感染特點(diǎn)與人乙型肝炎病毒類似，已被作為研究人乙型肝炎病毒的重要動物模型4,所以本實(shí)驗(yàn)采用先天感染的鴨乙肝模型，研究NAPP體內(nèi)抗乙肝病毒的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性藥物拉米夫定按20mg/（kg）劑量，連續(xù)灌胃10d,可顯著抑制DHBV-DNA,停藥3dDHBV-DNA顯著回升，與臨床結(jié)果相吻合，說明本次實(shí)驗(yàn)是成功的。受試藥物原嚇麻鈉10d療程中，各時點(diǎn)DHBV-DNA變化差異也有顯著性意義

14、（藥后5d,P0.05;藥后10d,P0.01）,停藥3dDHBV-DNA顯著回升，提示NAPP在鴨體內(nèi)對DHBV-DNA有明顯抑制作用。HBV-DNA轉(zhuǎn)染人類肝癌細(xì)胞株HepG2所建立HepG的2.2.15細(xì)胞株能有效表達(dá)HBV復(fù)制的全部標(biāo)志，是體外評價HBV藥物的較好模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAPP在所稀釋的各濃度下對HepG2215細(xì)胞分泌HBsAg,HBeAg均有一定的抑制作用，且抑制作用與藥物濃度呈一定的劑量依賴關(guān)系。NAPP和拉米夫定的治療指數(shù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2,提示NAPP和拉米夫定皆為高效低毒型藥物。本研究顯示NAPP在體內(nèi)外可有效抑制乙肝病毒的復(fù)制，其抑制病毒效果與拉米夫定相近，且毒副作用小，所以NAPP有望成為治療乙型病毒性肝炎的一種新藥，有進(jìn)一步研究的價值?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Chao-PinLi,Li-FaXu,Hong-QunLiu,etal.ExtractionofprotoporphyrindisodiumanditsinhibitoryeffectsonHBV-DNA：J.WorldJGastroenterol,2004,10(3)：433.：2陳淵卿，顧健人，蔣惠秋，等.斑點(diǎn)雜交試