氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用原理及應(yīng)用

1、氣相色譜氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜聯(lián)用原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用 簡介簡介 o 色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。o 色譜質(zhì)譜聯(lián)用包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用互為補充，分析不同性質(zhì)的化合物。 液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別: : o 氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。 o 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如

2、下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。 Analyte PolarityIonSprayAPCIGC/MS現(xiàn)代有機和生物質(zhì)譜進(jìn)展現(xiàn)代有機和生物質(zhì)譜進(jìn)展 o 在20世紀(jì)80及90年代，質(zhì)譜法經(jīng)歷了兩次飛躍。在此之前，質(zhì)譜法通常只能測定分子量500以下的小分子化合物。20世紀(jì)70年代，出現(xiàn)了場解吸離子化技術(shù)，能夠測定分子量高達(dá)1500 2000的非揮發(fā)性化合物，但重復(fù)性差。20世紀(jì)80年代初發(fā)明了快原子質(zhì)譜法（FAB-MS），能夠分析分子量

3、達(dá)數(shù)千的多肽。o 隨著生命科學(xué)的發(fā)展，欲分析的樣品更加復(fù)雜，分子量范圍也更大，因此，電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法（MALDI-MS）應(yīng)運而生。質(zhì)譜原理簡介：質(zhì)譜原理簡介： o 質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子信號強度為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)所作的條狀圖就是我們常見的質(zhì)譜圖。 常見術(shù)語常見術(shù)語:o 質(zhì)荷比質(zhì)荷比: 離子質(zhì)量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/Z.o 峰峰: 質(zhì)譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.o 離子豐度離子豐

4、度: 檢測器檢測到的離子信號強度.o 基峰基峰: 在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強度最大的離子峰稱作基峰.o 總離子流圖；質(zhì)量色譜圖；準(zhǔn)分子離子；碎片總離子流圖；質(zhì)量色譜圖；準(zhǔn)分子離子；碎片離子；多電荷離子；同位素離子離子；多電荷離子；同位素離子如何看質(zhì)譜圖：如何看質(zhì)譜圖：o (1)確定分子離子確定分子離子,即確定分子量即確定分子量o 氮規(guī)則：含偶數(shù)個氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是偶數(shù)，含奇數(shù)個氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是奇數(shù)。與高質(zhì)量碎片離子有合理的質(zhì)量差，凡質(zhì)量差在38和1013，2125之間均不可能，則說明是碎片或雜質(zhì)。(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學(xué)式確定元素組成，即確定分子式或碎片化學(xué)

5、式o 高分辨質(zhì)譜可以由分子量直接計算出化合物的元素組成從而推出分子式o 低分辨質(zhì)譜利用元素的同位素豐度，例:(3)峰強度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系峰強度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系o 豐度大反映離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定o 在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵電子越易被電離，容納正電荷能力越強，含支鏈的地方易斷，這同有機化學(xué)基本一致，總是在分子最薄弱的地方斷裂。質(zhì)譜解析的一般步驟質(zhì)譜解析的一般步驟o (適于低分辨小分子譜圖,若已經(jīng)是高分辨質(zhì)譜圖得到元素組成更好) o (1)核對獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當(dāng)o (2)綜合樣品其他知識：例如熔點，沸點，溶解性等理化性質(zhì)，樣品來源，光譜，波譜數(shù)據(jù)等.

6、o (3) 盡可能判斷出分子離子。o (4) 假設(shè)和排列可能的結(jié)構(gòu)歸屬：高質(zhì)量離子所顯示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31.意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3.o (5)假設(shè)一個分子結(jié)構(gòu)，與已知參考譜圖對照，或取類似的化合物，并作出它的質(zhì)譜進(jìn)行對比。有機質(zhì)譜的特點有機質(zhì)譜的特點o 優(yōu)點優(yōu)點:o (1)定分子量準(zhǔn)確，其它技術(shù)無法比。o (2)靈敏度高，常規(guī)10-710-8g,單離子檢測可達(dá)10-12g。o (3)快速，幾分甚至幾秒。o (4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS對于難分離的混合物特別有效, 其它技術(shù)無法勝任。o (5)多功能，廣

7、泛適用于各類化合物。局限性局限性:o (1)異構(gòu)體，立體化學(xué)方面區(qū)分能力差。o (2)重復(fù)性稍差，要嚴(yán)格控制操作條件。所以不能象低場NMR，IR等自己動手，須專人操作。o (3)有離子源產(chǎn)生的記憶效應(yīng)，污染等問題。o (4)價格稍顯昂貴，操作有點復(fù)雜。質(zhì)譜計框圖質(zhì)譜計框圖加速區(qū)真空系統(tǒng)計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器檢測記錄系統(tǒng)檢測記錄系統(tǒng) 質(zhì)量分析器分離并加以聚焦的離子束，按m/z的大小依次通過狹縫，到達(dá)收集器。經(jīng)接收放大后被記錄。M-15(CH3)M-17(OH,NH3)M-19(F)M-27(HCN,C2H3)M-29(CHO,C2H5)M-31(CH2OH,OCH3)M

8、-43(CH3CO,C3H7)M-45(OC2H5,COOH)M-79(Br)M-16(O,NH2)M-18(H2O)M-26(C2H2)M-28(CO,C2H4)M-30(NO)M-32(S,CH3OH)M-42(CH2CO,CH2N2)M-44(CO2,CS2)M-46(NO2,C2H5OH)M-127(I)M-35(Cl)Table.2 常見的離子碎片20 30 4050 6070 80 90 1004357m/z100(M )712972H2CCCH2OCH2H3CCH3H2CCOH3CCH2CH2CH3-m/z=57(75%)CCH2OCH2CH3H2CH3C-m/z=71(48%)

9、H2C CCH2OCH2H3CCH3Fig.11 3-己酮的MS圖譜氣相色譜氣相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在代謝組學(xué)中的應(yīng)用質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在代謝組學(xué)中的應(yīng)用2022-2-1719 代謝組學(xué)是以高通量、高靈敏度、高分辨率的現(xiàn)代儀器分析方法為手段，對細(xì)胞、體液、組織中所有代謝物進(jìn)行無偏向的定性與定量分析的一門學(xué)科。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有較高的檢測靈敏度和鑒定準(zhǔn)確度，通過標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫的比對可對代謝物進(jìn)行快速的鑒定，因此被廣泛應(yīng)用于生物樣品的代謝產(chǎn)物的檢測中。2022-2-1720在 GC-MS 檢測中選用衍生化試劑需注意衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜特性，即質(zhì)量碎片的特征性強，同時分子量要適中，既適合質(zhì)量型檢

10、測器檢測，也有利于與基質(zhì)干擾物分離。常用的衍生化試劑分為硅烷化、酰化和烷基化三類，其反應(yīng)原理及優(yōu)缺點見表 1，其中應(yīng)用最廣泛的是硅烷化試劑和?；噭?022-2-17212022-2-1722 利用 GC-MS 分析生物體內(nèi)的代謝物，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理及衍生化，預(yù)處理過程主要包括代謝淬滅、細(xì)胞濃縮、代謝物提取等。為獲取微生物具有代表性的樣品，分析時樣品的代謝組成分必須保證與取樣時一致，才能反映樣品當(dāng)時的代謝活動，因此這一反映特定生理狀態(tài)的代謝狀態(tài)必須要被“固定”住，直到分析完成，該過程稱為淬滅。由于不同微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同，對滲透壓的耐受程度以及膜通透性也存在差異，因此代謝淬滅所選擇的方法

11、也無法統(tǒng)一。2022-2-1723GC-MS 檢測中物質(zhì)的定性需要利用其質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索，故其分析過程離不開各種代謝途徑和生物化學(xué)的數(shù)據(jù)庫?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)已有較完善的書庫供搜索、使用，而代謝組學(xué)尚未有類似功能完備的數(shù)據(jù)庫，但一些生化數(shù)據(jù)庫可用于已知代謝物的生物功能解釋和未知代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定，如京都基因與基因組百科在代謝組學(xué)研究中，為確保分析數(shù)據(jù)的有效性與可靠性，需要進(jìn)行定量分析以減少樣品處理及檢測中產(chǎn)生的差異。 基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)轉(zhuǎn)人血清白蛋白水稻的代謝組學(xué)方法研究2022-2-1724 隨著生物技術(shù)的日趨成熟及基因工程的不斷發(fā)展， 轉(zhuǎn)基因作物品種日益增多。轉(zhuǎn)人血清白蛋白水稻是一種

12、可以從稻米中提取人血清白蛋白，用于醫(yī)療方面的水稻。對此水稻進(jìn)行代謝物研究，有利于轉(zhuǎn)基因作物安全性的評估，對研究基因功能，推進(jìn)代謝組學(xué)研究有重要意義。目前，在植物代謝物的研究中，氣質(zhì)聯(lián)用是比較常用的儀器，其分離效率高， 峰容量大、靈敏度高。Fiehn等用GC-MS檢測擬南芥葉子提取物中找到了326個化合物，并且半數(shù)可以確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，對代謝組學(xué)研究做出很大的貢獻(xiàn)。實驗方法2022-2-1725 將水稻種子脫殼；用混合球磨儀將水稻種子磨成細(xì)粉；將末分裝為100m/份，分別加入提取溶液，漩渦震蕩10s； 在熱混合儀上 浸提20min；離心機上離心2min，12200r/min；取上清液100，在真空

13、濃縮儀上充分干燥；加入內(nèi)標(biāo)物，干燥；加入衍生試劑衍生化處理，等待進(jìn)樣分析。在其他因素相同條件下提取后經(jīng)GC-MS檢測，通過峰個數(shù)的變化程度，確定最佳提取液。2022-2-1726 為增加樣品的穩(wěn)定性與揮發(fā)性， 進(jìn)樣前需進(jìn)行衍生化處理，衍生化試劑為鹽酸甲氧胺溶于吡啶（40mg/mL)該試驗設(shè)計個時間段進(jìn)行衍生處理，分別為30min,50min,70min,90min,110min以及個溫度10，20，30，40，50的單因素試驗。根據(jù) 相對峰面積和峰個數(shù)隨衍生時間和溫度的變化情況，找出最佳優(yōu)化條件。實驗方法2022-2-17272022-2-17282022-2-1729由GC-MS工作站得到的

14、數(shù)據(jù)經(jīng)過AMDIS軟件分析，得到的譜庫檢索結(jié)果共84個化合物 展望展望2022-2-1730 與代謝組學(xué)的其他分析手段如 LC-MS、CE-MS 相比，GC-MS 雖然較為成熟，但由于GC-MS 分析樣本中代謝物普遍需要衍生化預(yù)處理，造成多重峰、多重底物等現(xiàn)象，需要對其進(jìn)一步深入研究。1) 開發(fā)新型的衍生化試劑，使其與多個官能團發(fā)生衍生化反應(yīng)，可獲得重復(fù)性好的方法。2) 此外，研發(fā)在線的衍生化方法，保證代謝物的硅烷化 反應(yīng)程度的完全，還可利用與代謝物結(jié)構(gòu)/生理相似的標(biāo)準(zhǔn)品，模擬出相關(guān)代謝物潛在的影響，以提高分析的準(zhǔn)確性。3) 如何獲得可參照的內(nèi)標(biāo)物實現(xiàn)所有代謝物的絕對定量分析，也將成為 GC-MS 應(yīng)用于代謝組學(xué)中的研究重點。互聯(lián)網(wǎng)上有關(guān)互聯(lián)網(wǎng)上有關(guān)GC-MS的信息資