一株硫酸鹽還原菌的分離及生理生態(tài)特性的研究

1、第19卷增刊2004年6月地球科學進展A DVANC E I N E AR T H S C I ENCE SV o l.19S uppl.J u n.,2004文章編號:1001-8166(2004增-0527-06一株硫酸鹽還原菌的分離及生理生態(tài)特性的研究甄衛(wèi)東,任南琪,王愛杰,李建政(哈爾濱工業(yè)大學環(huán)境生物技術(shù)研究中心,黑龍江哈爾濱150090摘要:硫酸鹽有機廢水生物處理技術(shù)一直是人們關(guān)注的熱點,該種廢水處理的關(guān)鍵是如何在有效地去除C O D的同時,高效地去除SO2-4。厭氧生物處理系統(tǒng)中的硫酸鹽還原菌(S u lf a t e-R e du c i ngB ac t e r i a,S

2、R B在一定的條件下可以有效地將SO2-4還原而從廢水中去除。產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器是一個復雜的生態(tài)學系統(tǒng),在這個生態(tài)系統(tǒng)中,S R B起著最主要的生態(tài)學作用,要研究產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中的各種群的微生物的生理生態(tài)學,是非常復雜而且難以實現(xiàn)的。為了更方便地研究產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中的微生物生理生態(tài)學,比較好的做法是把在反應(yīng)器中數(shù)量上占優(yōu)勢,并且起主要功能的種群分離出來,對它們進行單獨和配合研究。本實驗就是利用滾管法和改進的H un ga t e技術(shù),在C O D/ SO2-4=3的穩(wěn)定階段,對產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中的S R B進行了分離,分離出在數(shù)量上占優(yōu)勢的S R B,命名為S R B-Z H07。在厭氧試管和三角瓶

3、中,進行了S R B-Z H07生理生態(tài)學研究。pH值對S R B-Z H07的生長和硫酸鹽去除率的影響,pH為7.0左右S R B-Z H07的生長狀況最好,在34 h,菌液的O D600n m 達到0.827,而其它pH下的O D600 n m各時刻最大只有0.08。在34 h時,SO2-4的去除速率達到38.06 m g/h,而pH值為3.0、4.0、5.0、8.0時各時刻SO2-4的去除速率最大為9.62m g /h。乳酸最有利于SO2-4的去除,于SO 2-4去除率為94.24%,其次為丙酸,28.81%,最差的是葡萄糖,13.6%,S R B-Z H07利用有機底物對硫酸鹽的還原率

4、從大到小依次為:乳酸>丙酸>丁酸>乙酸>乙醇>葡萄糖。C O D/S O2-4大于2.0時,SO 2-4的去除率為80%左右;C O D/S O2-4小于2.0時,SO2-4去除率迅速下降,降低到50%以下。S R B-Z H07在有氧和無氧條件下都能生長,但只有在無氧條件下才能有硫酸鹽的去除率。在有氧條件下,S R B-Z H07的生長速率要快于在無氧條件下S R B-Z H07的生長速率。S R B-Z H07代謝乳酸、丙酸、丁酸、戊酸終產(chǎn)物主要乙酸,所以當動態(tài)實驗出水乙酸含量比較高的時候硫酸鹽去除率比較高。出水乙酸的含量高是硫酸鹽去除率比較高的標志,而不是原

5、因。關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器;純種分離;硫酸鹽還原菌;生理生態(tài)特性中圖分類號:X13文獻標識碼:A從環(huán)境中分離硫酸鹽還原菌,并對其生物學特性進行研究,國內(nèi)已經(jīng)有人開展這方面的工作,張毅、劉克鑫等1,2,分別從四川化工總廠熱交換器中分離到一株嗜熱硫酸鹽還原菌和嗜鹽硫酸鹽還原菌,對它們的生物學特性進行了系統(tǒng)深入的研究。從處理含高濃度硫酸鹽的有機物廢水的生物處理反應(yīng)器產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中分離優(yōu)勢功能菌,并對其生態(tài)特性進行研究的報道還很少。對影響硫酸鹽還原菌的生態(tài)因子的研究,一些學者分別在生物處理反應(yīng)器中和純培養(yǎng)條件下,對pH等生態(tài)因子的影響進行了研究工作。張小里3研究油田注水井中分離到的純種硫酸鹽還原菌表

6、明,厭氧條件下,S R B適宜生長的pH區(qū)間為6.5 7.5,最佳pH為7.5,小于5.5或大于8.0時S R B不能生長,有氧條件下,S R B在pH為8.08.5時仍能生存乃至增殖。俞教義4研究從中原油田污水收稿日期:2004-04-10.*基金項目:國家高技術(shù)研究發(fā)展(863計劃項目(編號:2002 A A601310;國家自然科學基金項目(編號:50208006資助.作者簡介:葛良全(1962-,男,教授,博士生導師,主要從事核地球物理研究工作. E- m a i l:z henw i dong 365s ohu. c om分離的S R B,pH為6.07.0的油田污水對S R B生長

7、有利,p H=3.0時S R B也能大量繁殖。很多學者研究了C O D/S O2-4對硫酸鹽去除率有影響5,6。崔高峰利用U A SB反應(yīng)器對C O D/S O2-4影響SO2-4去除率進行了研究,當C O D/S O2-4比值大于2.0的時候,硫酸鹽的去除率在95%以上;當C O D/S O2-4比值為1.5的時候,硫酸鹽去除率為75%;當C O D/S O2-4比值為1.0時,硫酸鹽去除率為60%。S R B是一種厭氧菌,但它對氧氣有一定的耐受性,把S R B放到有氧環(huán)境中,短時間它不會失去活性7。1材料和方法1.1樣品來源用于分離菌種的樣品來自本實驗室長期穩(wěn)定運行的產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器(C S

8、 T R一體化產(chǎn)酸設(shè)備,運行條件進水C O D3000m g /L,進水SO2-41000 m g /L,H R T6 h,SO2-4容積負荷3.9 k g /(m3d(污泥負荷0.9 k g /(dV SS,溫度34+1,SO2-4去除率80% 85%。1.2培養(yǎng)基成分及其配制方法分離硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基配方:K2H P O40.5 g, N H4C l1.0 g,C a C l22H2O0.1 g,M g S O47H2O 2.0 g,酵母膏1.0 g,70%的乳酸鈉溶液4 m L,N a2SO4 0.5 g,刃天青溶液(0.1%1 m L,蒸餾水1000 m L。溶解后用10%氫氧化鈉溶液

9、調(diào)節(jié)p H=7.47.6,固體培養(yǎng)基再添加2%瓊脂,加入 1.2 g的F e(N H42(SO42。培養(yǎng)基的配制,以及微生物培養(yǎng)都采用H un ga t e技術(shù)81.3分離方法產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中的優(yōu)勢菌硫酸鹽還原菌在數(shù)量上應(yīng)該占優(yōu)勢,為了分離到在數(shù)量上占優(yōu)勢的硫酸鹽還原菌(S R B,對產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中的活性污泥進行了系列稀釋、培養(yǎng),認為能生長的最大稀釋倍數(shù)的試管中的S R B就是優(yōu)勢功能菌。對這樣的試管中的菌進行分離。污泥從反應(yīng)器中取出后,放到滅過菌的無氧具膠塞瓶中,用玻璃珠打碎,用無菌針管系列稀釋制成菌懸液,以亞鐵鹽為指示劑對硫酸鹽還原菌進行培養(yǎng),把最大稀釋倍數(shù)能生長的菌落挑取,純化,并對其

10、進行硫酸鹽還原測定,此過程反復進行,直到獲得純培養(yǎng)優(yōu)勢硫酸鹽還原菌為止。1.4p H對S R B生長和S O2-4去除率的影響以分離S R B的固體培養(yǎng)基(配方見1.2培養(yǎng)分離到的S R B將其接種于同樣配方的液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h作為液體菌種。取一些厭氧試管,裝入不同pH的培養(yǎng)基,滅菌后,接入10%的液體菌種,在34下進行培養(yǎng),定時取樣,測定600 n m處的O D 值和SO2-4的去除率,SO2-4的測定采用比濁法9。1.5底物對硫酸鹽還原菌硫酸鹽去除率的影響各種有機物濃度按照C O D為3000 m g /L,硫酸鹽濃度為1000 m g/L,其它成分按1.2。將培養(yǎng)24 h 的液體

11、菌種按照10%的接種量加到裝于厭氧瓶中的無菌培養(yǎng)基中,34下進行培養(yǎng)48 h,測定SO2-4的去除率。1.6氧對S R B生長和SO2-4去除率的影響將S R B接種于固體平板上(配方見1.2,分別進行有氧(將接種的平板放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)(把接種的平板放到厭氧罐中10,培養(yǎng)5d。氧氣對SO2-4去除率的影響:將S R B液體菌種(見1.4分別接種于嚴格用H un ga t e技術(shù)配制的液體培養(yǎng)基(配方見1.2,進行密封培養(yǎng)(培養(yǎng)瓶用膠塞和有氧培養(yǎng)(培養(yǎng)三角燒瓶用棉塞,10%的接種量,34,3d,測定SO2-4的去除率。1.7以乳酸作碳源不同C O D/S O2-4條件下SO2-4的去除

12、率將培養(yǎng)基中加入一定量的SO2-4,使它的濃度為1000 m g/L,加入一定的乳酸鈉溶液,使C O D分別為4000,3000,2000,1000,800,670,600,400,C O D/SO2-4分別為4,3,2,1,0.8,0.67,0.6,0.4,其他成分同1.2,接種液體菌種(見1.4,10%的接種量, 34,培養(yǎng)3d,測定SO2-4的去除率。1.8液相末端產(chǎn)物分析采用國產(chǎn)G C112型氣相色譜儀,氫火焰離子檢測器。測定條件是:擔體G D X-103(60-80目+2%H3P O4,填充柱長2 m×5 m m,載氣N2:50 m L/m i n, H2:50m L/m

13、i n,空氣:500 m L/m i n,柱箱最高溫度250,進樣室溫度200,離子室溫度240,柱溫100200,采取程序升溫:初始溫度100,初始時間2 m i n,升溫速度6/m i n,終止溫度200,終止時間8 m i n,進樣量2L。2結(jié)果與討論2.1S R B的分離利用滾管法和改進的H un ga t e技術(shù),在C O D/SO2-4=3的穩(wěn)定階段,對產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中的硫酸鹽還原菌進行了分離,分離出在數(shù)量上占優(yōu)勢的硫酸鹽還原菌,命名為S R B-Z H07。825地球科學進展第19卷 2.2p H對S R B-Z H07生長的影響pH是微生物生長的重要影響因子,細菌生長的pH都在

14、中性偏堿的范圍內(nèi)。而對于某種特殊的細菌,它適宜生長的pH值可能不在這個范圍,細菌適宜生長的pH值大都與它們長期生長的環(huán)境的pH一致。實驗運行的產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中的pH在6.06.5之間,是否從反應(yīng)器中分離出的S R B的最適pH也在此范圍內(nèi),研究了pH對S R B生長的影響,以吸光值作為S R B數(shù)量指標。由圖1可看出,在pH為7.0左右S R B-Z H07的生長狀況最好,在34 h,菌液的O D600 n m達到0.827,而其它pH下的O D600 n m各時刻最大只有0.08,說明在其它酸度條件下菌的生長都受到比較嚴重的抑制。圖1p H對S R B-Z H07生長的影響F i g.1G

15、r ow t h of S R B-Z H07i n d i ff ere n t pH va l u e2.3p H對S R B-Z H07硫酸鹽去除速率的影響測定不同pH條件下硫酸鹽的去除率,再除以時間得不同酸度條件下硫酸鹽的去除速率(圖2。從圖2可以看出在p H=7.0時,S R B-Z H07對硫酸鹽的去除速率要明顯大于其它幾種狀況,在34 h時,SO2-4的去除速率達到38.06 m g /h,而pH為3.0、4.0、5.0、8.0時各時刻SO2-4的去除速率最大為9.62m g /h,說明p H=7.0時菌的生長和硫酸鹽的去除效果均達到了最佳。S R B-Z H07所能忍受的pH值

16、范圍較窄,尤其是過低的pH值必定使S R B-Z H07代謝活性降低,難以進行硫酸鹽還原作用。如果僅從硫酸鹽還原的角度考慮,選擇中性偏堿的pH值可以保證硫酸鹽還原菌發(fā)揮更大的作用,而且相對較高的pH值可使反應(yīng)器內(nèi)H2S濃度較低,減輕H2S對S R B-Z H07的抑制作用。圖2不同酸度條件下S R B-Z H07對S O2-4的去除速率F i g.2R e m o val r a t e of S O2-4b yS R B-Z H07i n d i ff ere n t p H va l u e2.4不同底物對S R B-Z H07硫酸鹽去除率的影響產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中,S R B-Z H07用于

17、硫酸鹽還原的電子供體為乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、H2等。不同污泥來源,不同馴化條件下得到的生態(tài)系統(tǒng)中利用各種碳源的S R B-Z H07的分布必然有較大的差異,從而表現(xiàn)為S R B-Z H07對各種碳源的不同利用能力。在其他條件都相同的條件下,測定了不同底物對硫酸鹽去除率的影響。由圖3可以看出乳酸最有利于硫酸鹽的去除,SO2-4去除率為94.24%,其次為丙酸,28.81%,最差的是葡萄糖,13.6%,說明葡萄糖最不利于硫酸鹽的去除。S R B-Z H07利用底物對硫酸鹽的還原率從大到小依次為:乳酸>丙酸>丁酸>乙酸>乙醇>葡萄糖。2.5氧對S R B生長和硫酸鹽去

18、除率影響為測定在有氧環(huán)境中S R B能否生長,以及在有氧情況下S R B-Z H07對硫酸鹽的去除率大小,把S R B接種到固體培養(yǎng)基上,分別在有氧和無氧條件下培養(yǎng),結(jié)果見圖4,左邊的平皿在有氧條件下培養(yǎng),右邊的平皿在厭氧條件下培養(yǎng),可以看出在好氧和厭氧情況下硫酸鹽還原菌都得到了生長,但是在有氧情況下菌不變黑,而無氧情況下會變黑。說明在有氧情況下,S R B可能不能還原硫酸鹽。為了進一步驗證,分別在有氧和無氧條件下,測定了S R B對硫酸鹽的去除率。結(jié)果如圖5,有氧和無氧條件下,硫酸鹽的去除率分別為4.33%和46.57%,無氧下的去除率明顯高于有氧。如前所述,S R B在有氧和無氧條件下都能

19、生長,在兩種培養(yǎng)條件下,生長速度有什么不同?利用S R B在液體培養(yǎng)基上的培養(yǎng),測定了氧對S R B生長速度的影響。從圖6可以看925增刊甄衛(wèi)東等:一株硫酸鹽還原菌的分離及生理生態(tài)特性的研究 圖3不同底物對S R B-Z H07S O2-4去除率的影響F i g.3E ff ec t o f s ub s t r a t e s o n r e m o val r a t eo f S O2-4b y S R B-Z H07圖4氧對S R B-Z H07還原硫酸鹽的影響F i g.4E ff ec t o f oxyg e n o n r e m o val r a t eo f S O2-4

20、b y S R B-Z H07出,在起始階段,兩種情況下菌的濁度相差無幾,經(jīng)過對數(shù)期的迅速生長后,好氧環(huán)境下菌的濁度要明顯大于厭氧環(huán)境,而且最大菌濁出現(xiàn)的時間好氧情況下要比厭氧情況提前4小時做左右。2.6以乳酸作碳源不同C O D/S O2-4條件下硫酸鹽的去除率由圖7可以看出,隨著C O D/S O2-4比值的降低,硫酸鹽的去除率也呈下降的趨勢,在C O D/S O2-4=2.0之前,下降的趨勢不太明顯,之后硫酸鹽的去除率迅速下降。2.7S R B-Z H07代謝各種底物的產(chǎn)物從圖8可以看出,硫酸鹽還原菌代謝乙醇的終圖5氧氣對硫酸鹽去除率的影響F i g.5E ff ec t o f O2o

21、 n r e m o val r a t eo f S O2-4b y S R B- Z H07圖6氧氣對S R B-Z H07生長的影響F i g.6E ff ec t o f O2o n g r ow t h of S R B-Z H07圖7不同C O D/S O2-4條件下S O2-4的去除率F i g.7R e m o val r a t e of S O2-4i n d i ff ere n t C O D/S O2-4產(chǎn)物主要是乙酸,其次是丙酸和丁酸;丙酸的終產(chǎn)物035地球科學進展第19卷 主要是乙酸,之后是乙醇,還有丁酸和戊酸;丁酸的終產(chǎn)物主要是乙酸,其次是丙酸,還有一些乙醇;戊

22、酸的終產(chǎn)物主要是丁酸,其次是乙酸,還有一些丙酸;乳酸的終產(chǎn)物主要乙酸,其次是丁酸,之后是戊酸和丙酸?？傊?S R B 代謝各種揮發(fā)酸最多的終產(chǎn)物是乙酸,所以當動態(tài)實驗出水乙酸含量比較高的時候硫酸鹽去除率比較高。圖8S R B - Z H -07 代謝各種底物的產(chǎn)物 F i g.8 p r o du c t o f S R B - Z H -07 m e t a b o li z i n gs e v er al s ub s t r a t e3結(jié)論(1利用H un ga t e 技術(shù)從產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中分離出硫酸鹽還原菌,經(jīng)過驗證它們確實是純種,而且有還原硫酸鹽的能力。(2S R B - Z

23、H 07 在pH 為7.0 左右的生長狀況最好,而在其它酸度條件下菌的生長都受到比較嚴重的抑制。在pH 為7左右,S R B - Z H 07 對硫酸鹽的去除速率要明顯大于其它幾種狀況。(3乳酸最有利于硫酸鹽的去除,S R B - Z H 07 利用有機酸對硫酸鹽的還原率從大到小依次為:乳酸>丙酸>丁酸>乙酸。(4S R B - Z H 07 在有氧和無氧條件下都能生長,但在有氧條件下不能夠去除硫酸鹽,只有在無氧條件下才能有硫酸鹽的去除率。在有氧條件下, S R B - Z H 07 的生長速率要快于在無氧條件下 S R B - Z H 07的生長速率。(5以乳酸做唯一碳源,

24、隨著C OD / S O 2-4比值的降低,硫酸鹽的去除率也呈下降的趨勢,在 C O D /SO 2-4=2之前,下降的趨勢不太明顯,之后硫酸鹽的去除率迅速下降。(6S R B - Z H 07 代謝各種揮發(fā)酸最多的終產(chǎn)物是乙酸,所以當動態(tài)實驗出水乙酸含量比較高的時候硫酸鹽去除率比較高參考文獻( R e f ere n ce s :1張毅,劉克鑫,廖銀章,等.一株嗜熱的硫酸鹽還原菌的分離和生物學特性研究J .應(yīng)用與環(huán)境生物學報,1995 ,1(2:173-180.2張毅,劉克鑫,廖銀章,等.一株中度嗜鹽的硫酸鹽還原菌的分離和生理特性研究J .應(yīng)用與環(huán)境生物學報,1995 ,1(1:61-67.

25、3張小里,陳志昕,劉海洪,等.環(huán)境因素對硫酸鹽還原菌生長的影響J .中國腐蝕與防護報,2000 ,20(4:224-229.4愈敦義,彭芳明,劉小武.環(huán)境對硫酸鹽還原菌生長的影響J .材料保護,1996 ,29(2.1-2.5崔高峰. C O D / S O 2-4比值對硫酸鹽去除率影響的研究J .工業(yè)水處理,2000 ,20(2:29-31.6崔高峰,柯建明,王凱軍.C OD / S O 2-4值對硫酸鹽還原率的影響J.環(huán)境科學,2000 ,21(4:106-109.7楊文博等譯.微生物生物學(第八版M .北京:科學出版社,2001.834-839.8H unga t e R E. A r

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27、SULFATE -REDUCIN G BACTERIA FROM ACID OGENIC SULFATE -REDUCIN G REACTOR AND ON ECOLOGIC AL CHARACTERISTIC OF IT ZHEN W ei-dong，REN Nan-qi W ANG Ai jie，LI Jian-zheng ， ogy （ Research Center of Environm ental Biotechnol ，Harbin Institute of Technology， Harbin 150090 ， China ） Abstract： The biological

28、treating technology is alw ays the focus of researchers in the world. The key of this technology is to rem ove COD and SO 4 2 sim ultaneously and effectively. Sulfate-Reducing Bacteria（SRB） in anae2 robic biological treating system can reduce SO 4 to H 2 Sso as to rem ove SO 4 . Butacidogenic-desulf

29、ate reactor is 2 a com plicated ecological system ， SRB lead the m ost im portantrole in this system . To study physiological and ecological characteristic of each m icrobial group in this system is very difficult so isolating m ain functional group， ， SRB can sim plify this research. Preponderant p

30、opulations of sulfate-reducing bacteria in an acidogenic sulfate-reducing reactor w ere isolated using im proved H ungate technique and tube-rolling m ethod ， this sulfate-reducing bacteria w as nom inated as SRB ZH07. In anaerobic tube and conical flask physiological and ecol ogical characteristic

31、of SRB -ZH07 w ere studied. W hen pH 7.0 SRB ZH07 grew best at the culture m om ent 34 h，OD 600nm of the ， culture solution w as up to 0.827 ，w hile the highest OD 600nm of the culture solution under other pH is 0.08.W hen 7.0 pH ，rem ovalrate of SO 4 was up to 38.06 m g /h at34 h，while the greatest rem ovalof SO 4 was only 9.62 m g / hr w hen pH w as 3.0 ， ， ， 4.0 5.0 8.0. Lactic acid was m ost suitable to reduce SO 4 ，rem oval rate of SO 4 was up to 94.24 w hen lactic is the sole