石榴皮對(duì)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的保護(hù)作用

1、石榴皮對(duì)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的保護(hù)作用                                             作者：周本宏，王慧媛，吳玥，馮琪，

2、劉春，張杰   【摘要】  目的 研究石榴(Punica granatum L.)皮提取物對(duì)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用。方法 采用3種活性氧產(chǎn)生體系誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，設(shè)立模型對(duì)照組（MC）、正常對(duì)照組（NC）以及3個(gè)石榴皮提取物給藥組，觀察比較各組的丙二醛（MDA）含量。結(jié)果 同MC組相比，三組石榴皮提取物對(duì)黃嘌呤黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)、H2O2及UV照射3種方法引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的生成增加均有抑制作用，且有一定的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論 石榴皮對(duì)自由基引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  石榴；紅細(xì)胞

3、膜；脂質(zhì)過(guò)氧化Abstract:Objective   To investigate the protective effect of pomegranate pericarps (Punica granatum L.)on lipid peroxidation damage of erythrocyte membrane. Methods  Model of lipid peroxidation of erythrocyte membrane was made by three kinds of radicals generation systems， xant

4、hine（Xan）xanthine oxidase(XO) system, H2O2 , and UV light.Observation was made on the content of malondialdehyde (MDA).  Results   Compared with MC group, the increases of MDA content in the membrane induced by XanXO system, H2O2 or UV light in all of the three Punica granatum L.group

5、 were inhibited dosedependently.Conclusion  Punica granatum L.may protect erythrocyte membrane from the lipid peroxidative damage induced by radicals.Key words: Punica granatum L; erythrocyte membrane; lipid peroxidation脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生在需氧細(xì)胞中，是分子態(tài)的氧與不飽和脂肪酸作用的過(guò)程；自由基被證明廣泛地參與脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。細(xì)胞膜因富含飽和脂肪酸最易受自由基攻擊，自由基

6、對(duì)細(xì)胞膜的損傷主要是產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，引起膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而影響甚至損傷機(jī)體的功能而引起一系列疾病。如有報(bào)道指明活性氧自由基與哮喘、發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎、帕金森綜合征、唐氏癥、癡呆等疾病的發(fā)生有關(guān)1。自由基清除劑作為抗氧化劑，可以防止脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，從而預(yù)防機(jī)體因自由基產(chǎn)生的病變。許多陸生植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物都可以作為抗氧化劑，特別是帶有酚羥基的物質(zhì)，如黃酮、鞣質(zhì)、香豆素等2,3。     石榴(Punica granatum L.)是我國(guó)已知的最早的可食用的植物之一，在我國(guó)被廣泛的種植。我國(guó)5個(gè)最有影響的石榴產(chǎn)區(qū)分別是：山西臨潼、山東棗莊、安徽懷遠(yuǎn)、四

7、川會(huì)理、云南蒙自。石榴皮是石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木石榴的干燥果皮，在中藥中它被用來(lái)治療痢疾、細(xì)菌感染、腹瀉、寄生蟲病及出血等疾病。近來(lái)又有報(bào)道指出石榴皮還有殺精子4及抗淋球菌的作用5。因?yàn)槭衿ぶ兄饕绪焚|(zhì)，占總質(zhì)量的10.4%21.3%，多酚類化合物已被證明具有清除自由基的作用，所以石榴皮可能具有清除自由基而抗氧化的作用。     本實(shí)驗(yàn)用2種方法研究不同鞣質(zhì)含量的石榴皮提取物對(duì)大鼠紅細(xì)胞膜氧化損傷的保護(hù)作用。脂質(zhì)過(guò)氧化物可分解產(chǎn)生丙二醛（MDA），本實(shí)驗(yàn)用MDA的量來(lái)衡量脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)不同濃度的給藥組來(lái)研究抗氧化性和劑量的效應(yīng)關(guān)

8、系。1  材料     UV2800紫外分光光度計(jì)（Unico上海儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（3K30 Sigma 公司）；冷凍干燥機(jī)（Christ ALPHA 14）；大白兔，武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2003-0004；石榴皮（購(gòu)自武漢市藥材公司，經(jīng)武漢大學(xué)藥學(xué)院張洪教授鑒定為石榴科石榴屬石榴的果皮）；黃嘌呤（Xan）和黃嘌呤氧化酶（XO）（Sigma公司）；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒和丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2  方法2.1  實(shí)驗(yàn)藥物的制

9、備        稱取一定量石榴皮，粉碎，用3倍量的70的丙酮在室溫下浸漬約6 h，再超聲30 min，濾取濾液。其殘?jiān)僦貜?fù)以上操作3次，將濾液合并，濃縮，冷凍干燥，制成粉末。2.2  紅細(xì)胞膜的制備        兔全血在04 用低滲溶血法制備6，膜蛋白含量用考馬斯亮蘭試劑盒測(cè)定，得膜蛋白濃度0.7778 g/L。2.3  XanXO 體系誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化        反應(yīng)終體積為1.0

10、 mL。各取制得的紅細(xì)胞膜0.5 mL，分別加待測(cè)藥物0.1 mL（MC和NC組加pH7.4磷酸鹽緩沖液），置37 水浴15 min，再加1.0 mmoL/L的Xan溶液0.3 mL，0.4 U/mL的 XO 0.1 mL, 立即將反應(yīng)管置37 水浴1 h待測(cè)。對(duì)照組、空白組、0.3 mg/mL劑量組、0.5 mg/mL劑量組、1 mg/mL劑量組都分別檢測(cè)12次。2.4  UV照射誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化        反應(yīng)終體積為1 mL，內(nèi)含細(xì)胞膜0.5 mL及不同濃度的藥物0.1 mL（MC和NC組用pH7.4磷酸鹽緩沖

11、液代替），再加入0.4 mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)管置紫外燈下照射1 h后待測(cè)（MC組在同樣溫度下靜置而不放在紫外燈下）。對(duì)照組、空白組、0.3 mg/mL劑量組、0.5 mg/mL劑量組、1 mg/mL劑量組都分別檢測(cè)12次。2.5  脂質(zhì)過(guò)氧化物的檢測(cè)        采用MDA試劑盒測(cè)定,測(cè)定過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）含量以反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度。              

12、               2.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理         MDA數(shù)值采用±s表示，多組資料間的兩兩比較用t檢驗(yàn)， P< 0.05為差異有顯著性。     3  結(jié)果3.1  石榴皮對(duì)XanXO 體系誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的影響     圖1

13、顯示，與對(duì)照組比較，0.3 mg/mL劑量組的P值<0.05,0.5 mg/mL、1 mg/mL的劑量組的P值<0.01,說(shuō)明石榴皮對(duì)XanXO 體系誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA的生成有明顯的抑制作用。(*P<0.05,*P<0.01 vs model,n=6)圖1  石榴皮對(duì)XanXO 體系誘導(dǎo)兔紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的影響（略）Fig.1  Effects of P.G.extract on erythrocyte membrane lipid peroxidation induced by XanXO system3.2  石榴

14、皮對(duì)H2O2誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的影響     圖2顯示，與對(duì)照組比較，0.3 mg/mL劑量組的P值<0.05,0.5 mg/mL、1 mg/mL劑量組的P值<0.01,說(shuō)明石榴皮對(duì)H2O2誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA的生成有明顯的抑制作用。(*P<0.05,*P<0.01 vs model,n=6)圖2  石榴皮對(duì)H2O2誘導(dǎo)兔紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的影響（略）Fig.2  Effects of P.G.extract on erythrocyte membrane lipid peroxida

15、tion induced by H2O2 system3.3  石榴皮對(duì)紫外線（UVlight）誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的影響     圖3顯示，與對(duì)照組比較，0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的劑量組的P值均<0.01,說(shuō)明石榴皮對(duì)紫外線（UVlight）誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA的形成有明顯的抑制作用。     (*P<0.05,*P<0.01 vs model,n=6)圖3  石榴皮對(duì)UVlight誘導(dǎo)兔紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的影響（略）Fi

16、g.3  Effects of P.G.extract on erythrocyte membrane lipid peroxidation induced by UVlight4  討論             氧自由基可多方面氧化細(xì)胞，如細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白及DNA。因?yàn)榧?xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層組成，所以細(xì)胞膜很容易被氧自由基攻擊而發(fā)生過(guò)氧化。這些過(guò)氧化過(guò)程會(huì)產(chǎn)生很多的產(chǎn)物，如乙醛、過(guò)氧化氫及自由基等。    

17、0;        脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷7，從而會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)造成直接的損害。除此之外，過(guò)氧化物分解產(chǎn)物還會(huì)和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，進(jìn)一步損傷機(jī)體，可使DNA發(fā)生變異等8，9。脂質(zhì)過(guò)氧化物是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，其含量與自由基的濃度成正比。脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）在稀酸中加熱降解為丙二醛（MDA），MDA可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在532 nm處有最大吸收峰。本試驗(yàn)采用的MDA試劑盒可以準(zhǔn)確地反映出亞細(xì)胞水平的脂質(zhì)過(guò)氧化量10。   

18、0; 本實(shí)驗(yàn)為了觀察石榴皮提取液及其凍干粉對(duì)抗細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，采用了2種誘導(dǎo)氧化損傷體系，分別通過(guò)不同的機(jī)制產(chǎn)生自由基：在XanXO系統(tǒng)中，Xan在XO的催化下產(chǎn)生了超氧陰離子自由基（O2-·）：Xan+2O2+H2O尿酸O2-2H+。近年有學(xué)者應(yīng)用電子順磁共振（ERS）技術(shù)檢測(cè)到該體系有O2-·生成；而紫外線照射可使細(xì)胞膜懸液中的H2O2、O2和其它生物分子中的電子從低能軌道躍遷到高能軌道，稱為激發(fā)態(tài)分子，后者迅速分解成·OH、O2-·和生物分子自由基。本實(shí)驗(yàn)采用的2個(gè)損傷體系11中產(chǎn)生的自由基種類和損傷機(jī)制是有一定差異的，但石榴皮均能抑制脂質(zhì)

19、過(guò)氧化的形成，說(shuō)明它們的保護(hù)機(jī)制是多途徑的，是非特異性的自由基清除劑，其確切機(jī)理有待進(jìn)一步研究。     本實(shí)驗(yàn)顯示，石榴皮提取液及其凍干粉可以顯著抑制MDA的生成，這表明它們有阻止自由基生成或是清除自由基的作用。從而進(jìn)一步表明石榴皮提取物有抗氧化和保護(hù)細(xì)胞膜的作用。     實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，石榴皮提取物凍干粉較提取液有更強(qiáng)的抗氧化活性。這可能是因?yàn)閮龈煞壑械镊焚|(zhì)含量較高的原因，而鞣質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)中是主要的抗氧化活性物質(zhì)。但也不排除黃酮這種也有抗氧化的物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生正面影響。     本研究結(jié)果可能對(duì)由自由基引起的疾病的治療有一定的積極作用。石榴皮對(duì)自由基的作用，從本實(shí)驗(yàn)看來(lái)并不是特異性的，所以還需要通過(guò)更多的動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究石榴皮的抗氧化活性。【參考文獻(xiàn)】  1 ADAMS J D, ODUNZE I N.Oxygen free radicals and parkinson diseaseJ.Free Radical Biology and Medicine，1991，10：161-169.2 HAGYMASI K, BLAZOVICS A, FEHE R J, et al.