基因表達的檢測的幾種方法

1、精品基因表達檢測的最終技術(shù)目標是能確定所關注的任何組織、細胞的RNA的絕對表達量?？梢韵葟臉颖局谐樘酭NA，再標記RNA，然后將這些標記物作探針與芯片雜交，就可得出原始樣本中不同RNA的量。然而用于雜交的某個特定基因的RNA的量與在一個相應雜交反應中的信號強度之間的關系十分復雜，它取決于多種因素，包括標記方法、雜交條件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于檢驗兩個或多個樣本中的某種RNA的相對表達量。樣本之間某個基因表達的差異性（包括表達的時間、空間特性及受干擾時的改變）是基因表達最重要的，而了解RNA的絕對表達豐度只為進一步的應用或多或少地起一些作用。基因表達的檢測有幾種方法。經(jīng)典的

2、方法（仍然重要）是根據(jù)在細胞或生物體中所觀察到的生物化學或表型的變化來決定某一特定基因是否表達。隨著大分子分離技術(shù)的進步使得特異的基因產(chǎn)物或蛋白分子的識別和分離成為可能。隨著重組DNA技術(shù)的運用，現(xiàn)在有可能檢測分析任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前有好幾種方法廣泛應用于于研究特定RNA分子。這些方法包括原位雜交NORTHERN凝膠分析打點或印跡打點S1核酸酶分析和RNA酶保護研究。這里描述RT-PCR從RNA水平上檢查基因表達的應用。8f3f-|2L）K）b7-|RT-PCR檢測基因表達的問題討論關于RT-PCR技術(shù)方法的描述參見PCR技術(shù)應用進展，在此主要討論它在應用中的問題。理論上1山細胞質(zhì)總RNA

3、對稀有mRNA擴增是足夠了（每個細胞有1個或幾個拷貝）。1L差不多相當于50100，000個典型哺乳動物細胞的細胞質(zhì)中所含RNA的數(shù)量，靶分子的數(shù)量通常大于50，000，因此擴增是很容易的。該方法所能檢測的最低靶分子的數(shù)量可能與通常的DNAPCR相同；例如它能檢測出單個RNA分子。當已知量的轉(zhuǎn)錄RNA（用T7RNA聚合酶體外合成）經(jīng)一系列稀釋，實驗結(jié)果表明通過PCR的方法可檢測出10個分子或低于10個分子，這是反映其靈敏度的一個實例。用此技術(shù)現(xiàn)已從不到1個philadelphia染色體陽性細胞株K562中檢測到了白血病特異的MRNA的轉(zhuǎn)錄子。因此沒必要分離polyA+RNA，RNA/PCR法有

4、足夠的靈敏度來滿足絕大多數(shù)實驗條件的需要。7H+F&_*S6W（a8p:,-d,將PCR緩沖液同時用于反轉(zhuǎn)錄酶反應和PCR反應，可簡化實驗步驟。我們發(fā)現(xiàn)整個反應過程皆用PCR緩沖液的結(jié)果相當于或優(yōu)于先用反轉(zhuǎn)錄緩沖液合成CDNA，然后PCR緩沖液進行PCR擴增循環(huán)。當然，值得注意的是PCR緩沖液并不最適合第一條DNA鏈的合成。我們對不同的緩沖液用于大片段DNA合成是否成功還沒有進行過嚴格的研究。反轉(zhuǎn)錄酶的選擇似乎對實驗方法成功與否并不十分重要。BRL和BOEHRINGERMANNHEIM的MULV反轉(zhuǎn)錄酶進行全面的研究，但沒有理由認為來源可靠的反轉(zhuǎn)錄酶不能適用于該方法。在研究中，我們僅使

5、用了PERKINELMER/CETUS公司生產(chǎn)的TAQ聚合酶。cDNA第一條鏈的合成可用不規(guī)則六聚體、寡聚(dT)或PCR下游引物來啟動反應。如果用寡聚(dT)，一般每次反應加0.1山就夠了。如果用下游寡核甘酸作為第一條鏈的起始引物，10-50pmol最為理想。反轉(zhuǎn)錄反應以后，加入適量的上游和下游引物進行PCR反應與用不規(guī)則六聚體方法一樣。三種啟動方法中無論用那一種最后得到的擴增產(chǎn)物都同樣理想。而加入不規(guī)則六聚體似乎更容易得到前后一致的結(jié)果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.)加入不規(guī)則六聚體方法一樣。三種啟動方法中無論用那一種最后得到的擴增產(chǎn)物都同樣理想。而加入不規(guī)則六聚體似站更容易得到

6、事一致的結(jié)果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.未發(fā)表)。第一條鏈合成完畢，不必加堿或RNA酶以除去RNA模板。95熱處理使反轉(zhuǎn)錄酶失活，同時也使RNA-DNA雜合子變性。不必加堿或RNA酶以除去RNA模板。95熱處理使反轉(zhuǎn)錄酶失活，同時也使RNA-DNA雜合子變性。殘留的RNA模板似乎對PCR反應無干擾。5d'b"L&Q'y尋找使PCR反應產(chǎn)生良好擴增結(jié)果的最低濃度的寡核苷酸引物是十分重要的。我們發(fā)現(xiàn)過量的引物通常會產(chǎn)生許多妨礙隨后分析的額外擴增產(chǎn)物。濃度為5pmol的引物可得到非常清晰及有效的擴增產(chǎn)物。當然，最好是找到你要擴增的每個序列的最佳引物量。沒

7、有必要用全部的cDNA反應產(chǎn)物進行PCR擴增?？扇〉确至縞DNA樣品用幾組不同的引物作PCR分析;例如:一份cDNA反應物可用于研究幾種不同類型的RNA。cDNA反應物通常用PCR緩沖液衡釋5倍。將cDNA的濃度隆低至0.2mM，此濃度更適于Taq聚合酶。dNTP濃度不應超過0.2mM，因為較高濃度的dDTP使Taq聚合酶的錯誤摻入或突變率增高。對于擴增來說，即使dNTP的濃度低到0.05mM也不會出現(xiàn)問題。'R7z)H'u1(鎂離子濃度對反應十分重要，因此應注意將鎂的摩爾濃度保持恒定。有時核酸溶于含1mMEDTA的緩沖液中，EDTA可殲螯合大多數(shù)鎂離子。通常，PCR反應中游離

8、鎂離子濃度應保持在2mM。將PCRA循環(huán)次數(shù)減少，不可避免地產(chǎn)生許多非特異性的擴增產(chǎn)物。很容易將長度不同的DNA的擴增。即使基因組序列得到擴增，當引物與大小不同的外顯子結(jié)合時，很容易將長度不同的MRNA與基因組的產(chǎn)物區(qū)別一來。如果不了解基因組的結(jié)構(gòu)，選用與5"編碼基因間隔300-400bp的引物，脊椎動物的外顯子很少大于300-400bp，因此很容易從不同的外顯子中導出引物。如果所研究的基因無內(nèi)含子、或者研究完整原病毒RNA轉(zhuǎn)錄，為了獲得有關PCR的結(jié)果有必要用DNA酶徹底處理RNA。只要有很少量的基因組DNA污染，用此方法分析就會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。99o-(v;UN#%r$h9I-L

9、1i7(_+'-h實際應用舉例/W"1T.m$P0F$M+x基因表達檢測8p.zL9A'G7J"Qc8q7X用該方法先后擴增，檢測了許多不同類型的細胞、組織和器官的mRNA。當然，僅僅檢測mRNA并沒有新穎之處，它的新穎在于能對10-1000個細胞的RNA進行分析。所需起始物質(zhì)比通常的低很多，這使得研究者能設計并進行以前看是不可能進行的實驗。例如研究血細胞生成的研究人員經(jīng)常用群體分析確定生長因子或環(huán)境對特殊細胞系發(fā)育的影響。經(jīng)常部到的一個問題是:群體細胞產(chǎn)生的何種生長/分化因子會影響其本身的發(fā)育?，F(xiàn)在可以確信，利用RNA/PCR技術(shù)能夠?qū)?shù)百個群體的mRNA

10、對任何與生長或分化有關的因子進行分析。而用常規(guī)的雜交或抗體檢測方法來分析它們是極其因難、甚至是不可能的。RNA/PCR技術(shù)在研究轉(zhuǎn)基因動物方面將非常有用。我們常常不僅要知道在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移的基因是否表達，而且要知道是在哪些細胞組織或器官中表達。隨著RNA/PCR檢測靈敏度的提高，能夠檢測轉(zhuǎn)基因動物的多個部位而不必為取樣而將它處死。我們還可以列舉許多這樣的例子，但我們留給讀者一些有關檢測方面的設想。4A$ik2N2N,s(q用于診斷的RNA序列的擴增'n.u6Y&'!m:g(|/Z"j#i'V7_.l"f.h,e.M在許多情況下，一個特異性的RN

11、A分子可作為感染或遺傳/癌疾病的診斷。在反轉(zhuǎn)錄病毒疾病領域中，檢測與具有侵染活性密切相關的反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組或特異轉(zhuǎn)錄子是否存在是非常重要的。現(xiàn)已對HIV-1病人，HTLV-1，2以及MoloneyMulV的細胞株進行了研究。也可以用RNA/PCR比較容易地檢測出常見的感冒病毒即人鼻病毒。對RNA和DNA病毒的RNA轉(zhuǎn)錄子的分析有利于對病毒的潛伏期，復制期等生活周期進行研究。)T0%v7C5O7z'_!?-l$W)p9+p5w)在某些類型的癌細胞中有新的mRNA表達。如慢性骨髓性白血病(CML)某些急性淋巴白血病(ALL)和急性骨髓白血病(AML)，只在病人的白細胞中發(fā)現(xiàn)有嵌合的m

12、RNA(BCR-ABL)。此嵌合mRNA是診斷此類疾病存在的良好依據(jù)。在許多腫瘤的治療過程中，腫瘤細胞對化學治療具有抗性。DNA水平的擴增并不一定導致表達的增加，但大量相應的mRNA的存在則使表達增加。DNA水平的擴增并不一定導致表達的增加，但大量相應的cDNA的存在則使表達增加。用RNA/PCR方法來分析復合抗藥性(MDR)10基因和胸腺核苷酸合成酶(TS)基因，發(fā)現(xiàn)了這mRAN水平的增高.突變的RAS原癌基因的mRNA分析(見參考文獻25綜術(shù)述)在癌癥的診斷或預測方面具有診斷價值。mRNA分析比常規(guī)的DNA基因組分析有優(yōu)越之處。由于沒有內(nèi)含子序列干擾mRNA的擴增，因此可以僅用一組引物就能

13、夠擴增H-，K-，和N-RAS三個mRNA序列(E.S.K，未發(fā)表)。這樣便可以比較容易地檢測出第12、13和61密碼的突變，這些突變被認為是發(fā)生癌的原因。癌癥誘因的檢測3j.s)S/'v'f;g在下面將列舉數(shù)個RNA/PCR擴增方法的主要應用。首先是對鼠鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶mRNA進行亞克隆來確定缺失點突變的位置。同樣，該方法可用于檢測哺乳動物細胞mRNA轉(zhuǎn)錄后的剪接，研究與HLA疾病相關性因素，分析人HPRT突變，研究自身免疫與T細胞受體序列之間的關系，分析人堿性磷酸脂酶的突變，研究土撥鼠肝炎病毒引發(fā)的c-myc活性，確定刺桐丁蛋白4.1mRNA的剪接變異，等等。6p/l$I65WE5八；U9a$根據(jù)已發(fā)表的序列合成擴增mRNA的引物，我們發(fā)現(xiàn)用RNA/PCR是獲取cDNA的最簡便的方法。用在5"末端帶有限制性內(nèi)切酶位點的引物來擴增mRNA的一部分或全部編碼區(qū)域。擴增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)合適的酶切并與適于表達的載體連接或制備成探針。按此方法可在一星期內(nèi)完成從RNA樣品到用于高效表達的修飾cDNA克隆.這比常規(guī)的合成/篩選cDNA庫，亞克隆靶cDNA，為達到表達目的而對克隆進行誘變等過程要簡單得多。區(qū)別主要在于用于擴增和分離cDNA克隆的引物為簡并引物。引物