生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、組別：第六組組員：蘇琳偉、陳治、陳家和、陳硅報(bào)告人：陳硅學(xué)號(hào)：詞匯&釋義：Parafilm 封口膜Chloroform 氯仿（三氯甲烷）Isopropanol 異丙醇DEPC 焦碳酸二乙酯TRIZOL a mono-phasic solution of phenol and guanidine isothiocyanatePhenol 苯酚isthiocyanate 異硫氰酸胍MCS multiple cloning site （polycloning site）注：MSC是DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。實(shí)

2、驗(yàn)任務(wù)： 1. 從豬肌肉纖維中提取RNA;2. 2對(duì)RNA上EGFP基因密碼子片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增;3. 將經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增的cDNA與插入載體質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌進(jìn)行克??；4. 從大腸桿菌中提取含目的基因的載體質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握提取純化總RNA的原理和技術(shù)； 2.掌握RT-PCR原理和技術(shù)； 3.掌握TA克隆原理和技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：A 總RNA提取和純化RNA 分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA 酶外，環(huán)境中也存在大量RNA 酶。因此在提取RNA 時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA 酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA

3、酶污染和抑制內(nèi)源性RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA 酶，通過(guò)RNA 酶的阻抑蛋白R(shí)nasin 和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA 酶。Trizol試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑，是一種由苯酚和異硫氰酸胍組成的單相溶液它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性，裂解細(xì)胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過(guò)異丙醇沉淀來(lái)還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇

4、能沉淀出蛋白。共純化DNA對(duì)于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。無(wú)論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織，各種樣品最大使用量（1ml Trizol），動(dòng)物組織( 50mg)，植物組織(100 mg)，絲狀真菌( 100mg)，動(dòng)物細(xì)胞(5×1061×107)，酵母(1×107) 。TRIZOL試劑能促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見(jiàn)許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶，（mRNA和hnRNA成分）兩條優(yōu)勢(shì)核糖體RNA條帶位于5 kb (28S)和2 kb (18S)，低分子量RNA

5、介于0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA, 5S)。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)其A260/A280比值1.8 。Rnase 污染的10大來(lái)源 1：手指頭 2：槍頭 3：水/緩沖液4：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面 5：內(nèi)源 Rnase 6：RNA 樣品7：質(zhì)粒抽提 8：RNA 保存 9：陽(yáng)離子 (Ca, Mg) 10：后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶 RNA提取須杜絕外源酶的污染，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意一嚴(yán)格戴好口罩，手套。 二實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。 三實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。 RNA純化流程圖（附：上清不含DNA的原因：1.因?yàn)榧?xì)胞中存在DNA

6、酶，在提取之前細(xì)胞破碎的時(shí)候沒(méi)有加DNA酶抑制劑，DNA已經(jīng)被分解了。2.上層水相，PH 5.1左右，當(dāng)溶液pH在酸性的時(shí)候，DNA分子就會(huì)沉淀在酚與溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而當(dāng)pH接近中性時(shí)，DNA就會(huì)溶解在水相，（導(dǎo)致PH中性的大概原因是trizol與樣品比例不對(duì)，應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使trizol過(guò)量）RNA純化要求1 純化后不應(yīng)存在對(duì)酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)有抑制作用物質(zhì)2 排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染3 蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度4 排除DNA分子的污染BRT-PCR一、知識(shí)背景：1、基因表達(dá)：DNA RNA Protein單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，

7、如一個(gè)蠶絲心蛋白基因104 個(gè)絲心蛋白mRNA（每個(gè)mRNA 存活4d，可以合成105 個(gè)絲心蛋白） 共合成109 個(gè)絲心蛋白。因此單拷貝基因的mRNA 表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。2、PCR 技術(shù)(olymerase chain reaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA 聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：a、變性：通過(guò)加熱使DNA 雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；b、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。c、延伸：在DNA 聚合酶和dNTPs 及Mg2存在下，退火引物沿5 3方向

8、延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA 病毒體內(nèi)的依賴RNA 的DNA 聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA 的DNA 聚合酶活性：以RNA 為模板合成cDNA 第一條鏈；2、Rnase 水解活性：水解RNANA 雜合體中的RNA；3、依賴DNA 的DNA 聚合酶活性：以第一條DNA 鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.二、RT-PCR 的準(zhǔn)備：1、引物的設(shè)計(jì)及其原則：1）引物的特異性決定PCR 反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序

9、列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA 剪切方式以及可能存在的hnRNA 對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過(guò)程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2）引物設(shè)計(jì)原則的把握：引物設(shè)計(jì)原則包括a、引物長(zhǎng)度:一般為1530bp ，引物太短會(huì)影響PCR 的特異性，引物太長(zhǎng)PCR 的最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq 酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3 個(gè)以上的單一堿基。GC 含量（Tm 值）：4060，PCR 擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm 值減去510 度。c、3端要求：3端必須與模板嚴(yán)格

10、互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A 時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，G、C 居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C 而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的T。d、引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。e、引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4 個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)，3端不應(yīng)超過(guò)2 個(gè)。f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8 個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。g、5端無(wú)嚴(yán)格限制：5末端堿基可以游離，但最好是G 或C，使PCR 產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件

11、如Primer5.0，Oligo6.0 等對(duì)于這些條件都可以自行設(shè)置。二步法RT-PCR反應(yīng)流程圖示一部法RT-PCR反應(yīng)流程圖示CTA克隆a質(zhì)粒的基本特性1質(zhì)粒的復(fù)制    通常一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)（整個(gè)遺傳單位定義為復(fù)制子）。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可決定復(fù)制的方式，如滾環(huán)復(fù)制和 復(fù)制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于 pMB1 質(zhì)?；?ColE1 質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。圖 3-1 是其復(fù)制其始示意圖。 在復(fù)制時(shí)，首先合成前 RNA ，即前引物，并與 DNA 形成雜交體；而

12、后 RNase H 切割前 RNA ，使之成為成熟的 RNA ，并形成三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)，該引物引導(dǎo)質(zhì)粒的復(fù)制。形成的 RNA 可控制 RNA 形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí) Rop 增強(qiáng) RNA 的作用，從而控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。削弱 RNA 和 RNA 之間相互作用的突變，將增加帶有 pMB1 或（ColE1）復(fù)制子的拷貝數(shù)。        圖 帶 pMB1（或 ColE1） 復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒在復(fù)制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的方向及其粗略大小。 滾環(huán)復(fù)制：滾環(huán)式復(fù)制(rolling circle replication)是噬菌體中常見(jiàn)的DNA復(fù)制方

13、式。許多病毒DNA的復(fù)制、質(zhì)粒、F因子在接合(conufgation)轉(zhuǎn)移時(shí)其DNA的復(fù)制，以及許多基因擴(kuò)增時(shí)都采用這種方式。在以這種機(jī)制進(jìn)行的復(fù)制中，親代雙鏈DNA的一條鏈在DNA復(fù)制起點(diǎn)處被切開(kāi)，其5'端游離出來(lái)。這樣，DNA聚合酶便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。當(dāng)復(fù)制向前進(jìn)行時(shí)，親代DNA上被切斷的5'端繼續(xù)游離下來(lái)，并且很快被單鏈結(jié)合蛋白所結(jié)合。因?yàn)?'端從環(huán)上向下解鏈的同時(shí)伴有環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)繞其軸不斷的旋轉(zhuǎn)，而且以3'-OH端為引物的DNA生長(zhǎng)鏈則不斷地以另一條環(huán)狀DNA鏈為模板向前延伸，因而稱為滾環(huán)復(fù)制。由于只有一條DNA鏈?zhǔn)峭暾?/p>

14、的，因而在DNA解鏈時(shí)不會(huì)產(chǎn)生拓?fù)鋵W(xué)上的問(wèn)題，即未解鏈的雙螺旋區(qū)不會(huì)產(chǎn)生超螺旋。當(dāng)5'-端從環(huán)上解下來(lái)后不久，即與單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，以后可移動(dòng)的引發(fā)體便在其上形成，以引發(fā)RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶催化合成岡崎片段。這個(gè)過(guò)程與前述的DNA滯后鏈的合成一樣。最后由DNA聚合酶切除RNA引物，并填充間隙構(gòu)成完整的DNA鏈。5'端所以能從環(huán)上不斷解鏈，主要是由于DNA聚合酶及引發(fā)體構(gòu)成的復(fù)制體中的螺旋酶不停的向前移動(dòng)所致。在這種復(fù)制方式中，DNA的延伸可以一直進(jìn)行下去，產(chǎn)生的DNA鏈可以是親代DNA單位長(zhǎng)度的許多倍。這么長(zhǎng)的DNA鏈?zhǔn)侨绾无D(zhuǎn)變?yōu)閱挝婚L(zhǎng)度的DNA分子的，目前尚不

15、清楚?？赡苁怯商禺惖膬?nèi)切酶切開(kāi)產(chǎn)生單位長(zhǎng)度的子代DNA。這些DNA可自身環(huán)繞，或保持線性分子狀態(tài)。某些質(zhì)粒進(jìn)行的滾環(huán)復(fù)制與噬菌體進(jìn)行的滾環(huán)復(fù)制并非完全的相同，它們至少存在以下幾點(diǎn)差別：1.質(zhì)粒在進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制時(shí)，正鏈和負(fù)鏈必須等量復(fù)制。2.具有兩個(gè)復(fù)制起始區(qū)，即雙鏈起始區(qū)和單鏈起始區(qū)，它們分別起動(dòng)前導(dǎo)鏈（正鏈）和后隨鏈（負(fù)鏈）的合成。滾環(huán)復(fù)制特點(diǎn)：1、以親本鏈（+鏈）為模板合成互補(bǔ)的環(huán)狀負(fù)鏈，形成閉合環(huán)狀的復(fù)制形RF1；2、以成環(huán)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生多個(gè)子代RF；3、以RF的負(fù)鏈為模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生多拷貝正鏈單環(huán)。滾環(huán)復(fù)質(zhì)圖示型復(fù)制DNA在復(fù)制原點(diǎn)解開(kāi)成單鏈狀態(tài),分別作為模板,各自合成其互補(bǔ)鏈,則出現(xiàn)

16、兩個(gè)叉子狀的生長(zhǎng)點(diǎn),叫做復(fù)制叉。復(fù)制過(guò)程中，由于形狀像希臘字母,因而叫復(fù)制,又叫Cairns復(fù)制,其復(fù)制中間體稱為Cairns分子。在復(fù)制中為雙向復(fù)制。大多數(shù)生物為雙向等速?gòu)?fù)制,也有少數(shù)雙向不等速?gòu)?fù)制的情況。型復(fù)制圖示2質(zhì)粒的拷貝數(shù)    質(zhì)?？截悢?shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型與松馳型。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)有限，大約 1 幾個(gè)；松馳型質(zhì)?？截悢?shù)較多，可達(dá)幾百。表 5-1 就是不同類的質(zhì)粒與復(fù)制子及拷貝數(shù)的大致關(guān)系。表 3-1 ：質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)質(zhì)粒 復(fù)制子 拷貝數(shù) pBR322 及其衍生質(zhì)粒 pMB1 1520 pUC 系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒 突變的 pMB1 50

17、0700 pACYC 及其衍生質(zhì)粒 p15A10212pSC101 及其衍生質(zhì)粒pSC101 5 ColE1ColE11520pUC 系列質(zhì)粒的復(fù)制單位來(lái)自質(zhì)粒 pMB1 ，但其拷貝數(shù)較高。 pMB1 質(zhì)粒的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶（DNA 聚合酶 ，DNA 聚合酶 ），依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和 danZ 的產(chǎn)物。因此，存在抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時(shí)，帶有 pMB1（或 ColE1） 復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中可積聚 23 千個(gè)質(zhì)粒。3質(zhì)

18、粒的不相容性 兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及 DNA 限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。兩個(gè)不相容性質(zhì)粒在同一個(gè)細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，在分配到子細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)競(jìng)爭(zhēng)，隨機(jī)挑選，微小的差異最終被放大，從而導(dǎo)致在子細(xì)胞中只含有其中一種質(zhì)粒。而不相容群指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般具有相同的復(fù)制子。在大腸桿菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 30 多個(gè)不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。4轉(zhuǎn)移性 質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿

19、主內(nèi)。它需要移動(dòng)基因 mob ，轉(zhuǎn)移基因 tra ，順式因子 bom 及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點(diǎn) nic。二、標(biāo)記基因    按其用途可將標(biāo)記基因分為選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記用于鑒別目標(biāo) DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)，篩選標(biāo)記可用于將特殊表型的重組子挑選出來(lái)。（一） 選擇標(biāo)記抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標(biāo)記。1氨芐青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）    氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標(biāo)記，絕大多數(shù)在大腸桿菌中

20、克隆的質(zhì)粒載體帶有該基因。青霉素可抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合并抑制其活性，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。氨芐青霉素抗性基因編碼一個(gè)酶，該酶可分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化 -內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。青霉素是一類化合物的總稱，其分子結(jié)構(gòu)由側(cè)鏈 R-CO- 和主核 6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在 6-APA 中有一個(gè)飽和的噻唑環(huán)（A）和一個(gè) -內(nèi)酰胺環(huán)， 6-APA 為由 L- 半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽。 2四環(huán)素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr）    四環(huán)素可與核糖體

21、30S 亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。四環(huán)素抗性基因編碼一個(gè)由 399 個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 pBR322 質(zhì)粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外，還帶有四環(huán)素抗性基因。3氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）    氯霉素可與核糖體 50S 亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。目前使用的氯霉素抗性基因來(lái)源于轉(zhuǎn)導(dǎo)性 P1 噬菌體（也攜帶 Tn9）。cat 基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，一個(gè)四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白（每個(gè)亞基 23kDa）。在乙酰輔酶 A 存在的條件下，該蛋白催化氯

22、霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結(jié)合。4卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）    卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因?qū)嶋H就是一種編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH（3'）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可使這兩種抗生素磷酸化，從而干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)移。在細(xì)胞中合成的這種酶可以分泌至外周質(zhì)腔，保護(hù)宿主不受這些抗生素的影響。5琥珀突變抑制基因 supF &#

23、160;  在基因的編碼區(qū)中，若某個(gè)密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)?UAA），或琥珀突變（突變?yōu)?UAG），或乳白突變（突變?yōu)?UGA）。 supF 基因編碼細(xì)菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密碼子上編譯酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突變的 tetr 基因和 ampr 基因，只有當(dāng)宿主含有 supF 基因時(shí)才會(huì)對(duì) Amp 和 Tet 具有抗性。相應(yīng)的， supE 基因在 UAG 密碼子上編譯谷氨酰氨。由于目前所用的標(biāo)記基因使用方便，因此用這類標(biāo)記的載體較少。6其它    還有一些正向選擇標(biāo)記，

24、表達(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，來(lái)自淀粉水解芽胞桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養(yǎng)基上 sacB 基因的表達(dá)對(duì)大腸桿菌來(lái)說(shuō)是致死的，因此該基因可用于插入失活篩選重組子。（二）篩選標(biāo)記    篩選標(biāo)記主要用來(lái)區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個(gè)外源 DNA 片段插入到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)，可通過(guò)該標(biāo)記來(lái)篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。1-互補(bǔ)（-complementation）    

25、-互補(bǔ)是指 lacZ 基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的 -半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 個(gè)氨基酸組成）陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。-互補(bǔ)是基于在兩個(gè)不同的缺陷 -半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。大腸桿菌的乳糖 lac 操縱子中的 lacZ 基因編碼 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因發(fā)生突變，則不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了編碼 -半乳糖苷酶中第 11-41 個(gè)氨基酸的 lacZ 基因，無(wú)酶學(xué)活性。對(duì)于只編碼 N-端 140 個(gè)氨基酸的 lacZ 基因 （稱為 lacZ'） ，其產(chǎn)物也沒(méi)

26、有酶學(xué)活性。但這兩個(gè)無(wú)酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù) -半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。    在 lacZ' 編碼區(qū)上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響 -半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。但是，若在該 DNA 小片段中再插入一個(gè)片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)-互補(bǔ)能力的 -半乳糖苷酶片段。利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZM15 放在 F 質(zhì)粒上, 隨宿主傳代； lacZ' 放在載體上, 作為篩選標(biāo)記 （圖 3-2） 。相應(yīng)的受體菌有 JM 系列、

27、 TG1 和 XL1-Blue ，前二者均帶有 D （lac - proAB）F' proAB + lacIq lacZD M15 基因型。其中 lacI 為 lac 阻抑物的編碼基因，lacIq 突變使阻抑物產(chǎn)量增加，防止 lacZ 基因滲漏表達(dá)。    lacZ 基因是乳糖 lac 操縱子中編碼 -半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達(dá)。 乳糖既是 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。異丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物； 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（

28、X-gal） 可作為 lac 操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物 X-gal 還可充作生色劑，被 -半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。   2插入失活    通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有 pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，導(dǎo)致 tetr 基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過(guò)對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來(lái)篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質(zhì)粒載體的種類（一）克隆載體  

29、60; 克隆載體主要用于擴(kuò)增或保存 DNA 片段，是最簡(jiǎn)單的載體。1pBR322       pBR322 質(zhì)粒的大小為 4361bp ， GenBank 注冊(cè)號(hào)為 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多個(gè)單一位點(diǎn)，具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr），其質(zhì)粒復(fù)制區(qū)來(lái)自 pMB1 （如圖 3-3）。目前使用廣泛的多質(zhì)粒載體幾乎都是由此發(fā)展而來(lái)的。利用四環(huán)素抗性基因內(nèi)部的 BamH 位點(diǎn)來(lái)插入外源 DNA 片段，可通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選。2pUC18 和 pUC19 

30、60;  pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注冊(cè)號(hào)為 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而來(lái)，其中 lacZ （MSC） 來(lái)自 M13mp18/19 圖 3-4 是其質(zhì)粒圖譜。    這兩個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣 的，只是多克隆位點(diǎn)的排列方向相反。這些質(zhì)粒缺乏控制拷貝數(shù)的 rop 基因，因此其拷貝數(shù)達(dá) 500-700 。 pUC 系列載體含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特

31、定的受體細(xì)胞中可表現(xiàn) -互補(bǔ)作用。因此在多克隆位點(diǎn)中插入了外源片段后，可通過(guò) -互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。          圖 3-4 ： pUC18/19 質(zhì)粒圖譜3pUC118 和 pUC 119  由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而來(lái)，大小為 3162bp ， GenBank 注冊(cè)號(hào)為 U07649（pUC118）和 U07650（pUC119）。相當(dāng)于在 pUC18/19 中增加了帶有 M13 噬菌體 DNA 合成的起始與終止以及包裝進(jìn)入

32、噬菌體顆粒所必需的順式序列。4pGEM-3Z/4Z  pGEM-3Z/4Z由pUC18/19 增加了一些功能片段改造而來(lái)，大小為 2.74kb, GenBank 注冊(cè)號(hào)為 X65304（pGEM-3Z, 2743bp）和 X65305（pGEM-4Z, 2746）。與 pUC18/19 相比，在多克隆位點(diǎn)的兩端添加了噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如 Sp6 和 T7 噬菌體的啟動(dòng)子。 pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差別在于二者互換了兩個(gè)啟動(dòng)子的位置。5多功能質(zhì)粒載體  在上述載體的基礎(chǔ)上，人們?cè)O(shè)計(jì)出一些多功能的質(zhì)粒載體，這類質(zhì)粒載體綜合了以上質(zhì)粒的特點(diǎn)。除

33、了作為質(zhì)粒載體基本要素外，綜合了上述功能要素，如多克隆位點(diǎn)、 -互補(bǔ)、噬菌體啟動(dòng)子和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制與包裝信號(hào)。典型的這類質(zhì)粒有 pBluescriptKS（±），這類質(zhì)粒一般由 4 個(gè)質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點(diǎn)方向相反（根據(jù)多克隆位點(diǎn)兩端 Kpn 和 Sac 的順序，用 KS 或 SK 表示），或單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制啟始方向相反（或者說(shuō)，引導(dǎo) DNA 雙鏈中不同鏈合成單鏈 DNA ，用 + 或 - 表示）， pBluescriptKS（+） 的 GenBank注冊(cè)號(hào)為 X52327 。 pBluescriptKS（±） 的多克隆位點(diǎn)與 pUC18/19 的不同，且

34、使用 f1 噬菌體的復(fù)制與包裝信號(hào)序列，質(zhì)粒圖譜如圖 3-5 。             6表達(dá)載體    該類載體是在常規(guī)克隆載體的基礎(chǔ)上衍生而來(lái)的，主要增添了強(qiáng)啟動(dòng)子，以及有利于表達(dá)產(chǎn)物分泌、分離或純化的元件，有關(guān)本次實(shí)驗(yàn)使用的b本次實(shí)驗(yàn)所用pGEM®-T Easy 載體的有關(guān)信息載體圖譜 pGEM®-T 載體和pGEM®-T Easy 載體多克隆位點(diǎn)序列pGEM®-T Easy 載

35、體圖和相關(guān)序列位點(diǎn)pGEM®-T Easy 載體相關(guān)的序列位點(diǎn)T7 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 1多克隆位點(diǎn)區(qū) 10128SP6 RNA 聚合酶啟動(dòng)子（17 至3） 139158SP6 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 141pUC/M13 反向測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn) 176197lacZ 起始密碼子 180lac 操縱子 200216內(nèi)酰胺酶編碼區(qū) 13372197噬菌體f1 區(qū) 23802835lac 操作子序列 28362996, 166395pUC/M13 正向測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn) 29562972T7 RNA 聚合酶啟動(dòng)子（17 至3） 29993pGEM®-T 和pGEM

36、74;-T Easy 載體的特殊應(yīng)用1PCR 產(chǎn)物的克隆。2采用Erase-a-Base®系統(tǒng)構(gòu)建不定向巢式缺失體。3單鏈DNA 制備。4重組子的藍(lán)白斑篩選。5利用雙向啟動(dòng)子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。注意平端PCR 產(chǎn)物(來(lái)自質(zhì)粒載體說(shuō)明書(shū))具有校正活性的熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶如Pfu DNA 聚合酶 (產(chǎn)品目錄號(hào)：M7741)，Pwo DNA 聚合酶，Tli DNA 聚合酶（目錄號(hào)M7101）在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生平端PCR產(chǎn)物。這種平端PCR 產(chǎn)物可以通過(guò)加A 尾程序后（圖4），連接到pGEM®-T 和pGEM®-TEasy 載體中（6）。采用這種方法連接，只有一個(gè)片段

37、插入，而平端連接克隆可能產(chǎn)生多個(gè)插入。另外采用T 載體克隆不需要對(duì)載體去磷酸化，載體自連的背景很低。Pfu 和Tli DNA 聚合酶產(chǎn)生的PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)加尾處理，并以理想載體：插入片段比例進(jìn)行連接，可得到5595重組子（表2）。值得注意的是，PCR 產(chǎn)物有必要采用Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System(d) (Cat.# A9281)進(jìn)行PCR 產(chǎn)物直接純化或凝膠純化。若PCR 產(chǎn)物不進(jìn)行純化，Pfu、Pwo 和Tli DNA 聚合酶的校正活性在進(jìn)行加尾反應(yīng)或連接反應(yīng)時(shí)，可降解PCR 片段的3-A 或除去加尾反應(yīng)的載體的3-T突出端。為了提高克

38、隆效率，應(yīng)根據(jù)純化PCR 產(chǎn)物的摩爾濃度調(diào)整加尾反應(yīng)中的DNA 量和連接需要的體積。當(dāng)PCR 產(chǎn)物片段小或擴(kuò)增反應(yīng)良好，產(chǎn)物的摩爾濃度高，加尾或連接反應(yīng)需要的體積很小。相反，如果PCR 片段比較大或擴(kuò)增不好，產(chǎn)物的摩爾濃度低，則需要較大的體積。我們已成功地用Taq DNA 聚合酶 對(duì)1-7l 純化的平端PCR片段進(jìn)行加尾反應(yīng)，并優(yōu)化插入片段:載體的連接比例，參見(jiàn)章節(jié)IV.C 詳細(xì)討論了插入片段:載體比例的優(yōu)化。轉(zhuǎn)化后采用藍(lán)白斑篩選重組子，結(jié)果70100的重組子含有PCR 擴(kuò)增的DNA 片段，而PCR 片段沒(méi)有加尾的對(duì)照反應(yīng)，只有很少的重組子。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大多數(shù)pGEM®-T Ea

39、sy 載體含有3-T，并且Taq DNA 聚合酶可成功對(duì)大多數(shù)PCR 片段加上3-A。 優(yōu)化插入片段和載體的摩爾比pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體系統(tǒng)優(yōu)化的插入DNA 對(duì)照片段和載體的摩爾比為1:1，采用8:1 到1:8 的連接比例也可成功進(jìn)行連接。如果你的PCR 產(chǎn)物開(kāi)始的連接不理想，則有必要優(yōu)化連接比例。一般開(kāi)始采用3:1 到1:3 的連接比例。PCR 產(chǎn)物的濃度可通過(guò)凝膠電泳上的DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行估計(jì)或采用熒光定量。pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體大概3kb 大小，系統(tǒng)提供的載體濃度為50ng/l。計(jì)算連接反應(yīng)中

40、需要的PCR 產(chǎn)物的量可采用以下公式:加入載體的量（ng）×插入片段大小（kb）載體大小kb×插入片段和載體的摩爾比3:1=插入片段的量根據(jù)推薦的不同插入片段:載體比例加入足夠的pGEM®-T 和pGEM®-T Easy載體進(jìn)行連接，并進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)。c 重組T質(zhì)粒的構(gòu)建外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連

41、接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái)。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。因?yàn)镈NA片斷有兩個(gè)端點(diǎn)，所以切割時(shí)

42、出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。對(duì)于單酶切來(lái)說(shuō)，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進(jìn)行，這樣就導(dǎo)致了大量的自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對(duì)載體進(jìn)行5除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3OH末端與5端，所以除磷后載體不會(huì)自環(huán)。一旦有外源片斷插入時(shí)，由外源片斷提供5端就能與載體進(jìn)行連接。通過(guò)這種方法可大大減少由載體的自 環(huán)造成的高本底。對(duì)于雙酶切來(lái)說(shuō)，無(wú)論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個(gè)特點(diǎn)是能將供體分子定向連接到載體上。 連接反應(yīng)的溫度在37

43、時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16，連接12-16h（過(guò)夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Taq DNA酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。d 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與篩選（1） 感受態(tài)細(xì)胞（Competent cells）:受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如CaCl，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA的載體分子通過(guò)，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞（2） 轉(zhuǎn)化（transforma

44、tion）：是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。注意： 轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。（3） 轉(zhuǎn)化的方法：i化學(xué)方法（熱擊法）：使用化學(xué)試劑（如CaCl2、RuCl等）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)熱擊處理將載體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞； ii電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)高壓麻脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體連接反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化步驟一定要使用高效率的感受態(tài)細(xì)胞（1×10

45、8 cfu/g DNA）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因?yàn)椴捎脝螇A基突出端進(jìn)行連接不是很有效，采用轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞1×108 cfu/g DNA（或更高）可得到合理的克隆菌數(shù)目（參見(jiàn)章節(jié)VI. E）。我們建議使用JM109 高效感受態(tài)細(xì)胞（產(chǎn)品目錄號(hào)：L2001），pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體系統(tǒng)提供這種感受態(tài)細(xì)胞。也可使用其他宿主菌，但是它們應(yīng)該適合用藍(lán)白斑及氨芐進(jìn)行篩選。在使用JM109 制備感受態(tài)細(xì)胞前，JM109 應(yīng)保存在含加維生素B1 的M9 基本培養(yǎng)基中，這有助于F因子的選擇，F(xiàn)因子帶有proAB 基因，這和脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌（proAB 基

46、因缺失）是互補(bǔ)的，攜帶的lacIqZM15 對(duì)于藍(lán)白斑篩選是必需的。如果你不采用Promega 公司JM109 高效率感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)按照后面的轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行操作。在LB/氨芐/IPTG/X-Gal 平板篩選轉(zhuǎn)化子（參見(jiàn)章節(jié)XI. A），為得到理想的結(jié)果，最好不要使用放置超過(guò)1 個(gè)月的平板。篩選含插入片段的轉(zhuǎn)化子插入片段成功克隆到pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體中，可阻斷 半乳糖苷酶的編碼序列，因而重組克隆可在指示培養(yǎng)基上通過(guò)顏色進(jìn)行篩選。然而連接到pGEM®-T和pGEM®-T Easy 載體的PCR 產(chǎn)物的特點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)化后藍(lán)白斑克隆菌的比例影

47、響很大。大多數(shù)情況下含有PCR 產(chǎn)物的克隆菌為白色，如果PCR 片段和LacZ 基因在同一讀碼框，則重組克隆菌可能為藍(lán)色。這種DNA 片段堿基數(shù)是3 的整數(shù)倍（含3-A），并且讀碼框無(wú)終止密碼子。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在同一讀碼框內(nèi)插入長(zhǎng)達(dá)2kb 的DNA 片斷，重組克隆菌仍可能為藍(lán)色。即使PCR 產(chǎn)物不是3 的整數(shù)倍大小，由于擴(kuò)增反應(yīng)可引入突變（缺失或點(diǎn)突變），也可造成pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體和片段連接轉(zhuǎn)化后，重組克隆菌為藍(lán)色。pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體系統(tǒng)的對(duì)照DNA 為542bp，來(lái)源于Promega公司pGEM

48、®-luc（b,個(gè)g）DNA (Cat.#E1541)，這個(gè)DNA 序列被引入突變，在6 個(gè)讀碼框中含有多個(gè)終止密碼子，從而確保對(duì)照反應(yīng)產(chǎn)生的藍(lán)色克隆菌的背景數(shù)很低。由此可見(jiàn)，插入DNA 對(duì)照的結(jié)果不能代表你的PCR 產(chǎn)物的連接結(jié)果。（這就解釋了為什么對(duì)菌落進(jìn)行插入片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)凝膠電泳分析是必要的。）E. 質(zhì)粒提取細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染 色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制， 并通

49、過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì) 粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性 而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)。 純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離 子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方

50、法，但這些方法相對(duì)昂貴或費(fèi)時(shí)。對(duì)于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過(guò)苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀 等簡(jiǎn)單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 中常用。 一、試劑準(zhǔn)備1. 溶液: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min ，貯存于4。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要

51、控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，無(wú)非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完 成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被

52、降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你， 只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。NaOH也使DNA變性，但只是個(gè)副產(chǎn)物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，質(zhì)粒DNA恢復(fù)活性2. 溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置 。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無(wú)非是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿 性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要

53、是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向 micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)?SDS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù) 性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)

54、胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千 萬(wàn)不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪M DNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。3. 溶液：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存?zhèn)溆谩Ｈ芤篒II加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大

55、量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量 的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加 入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量 要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看

56、來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度 的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì) 沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被SDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共

57、沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電 泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無(wú)法快速?gòu)?fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也 好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來(lái)是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來(lái)其實(shí)沒(méi)有關(guān)系。溶液 III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。  4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH

58、 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?.苯酚/氯仿 /異戊醇（25：24：1）不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn) 定的質(zhì)粒DNA，不然時(shí)間一長(zhǎng)就會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個(gè)全面的介紹。酚 （Phenol）對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來(lái)最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度

59、的鹽溶液（比如4M的 異硫氰酸胍），離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點(diǎn)，酚與水 有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一 次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會(huì)被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于 異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。6.乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來(lái)。這時(shí)候如果放到20，時(shí)間一長(zhǎng)反而會(huì) 導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點(diǎn)不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過(guò)分小心了。高濃度的鹽會(huì)水合大量的水分子，因此