鏈霉素誘變育種的方案ppt課件

1、11 11級生物技術(shù)班級生物技術(shù)班第二組第二組插曲(很有必要) 所處置的細(xì)胞必需是處于對數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，所處置的細(xì)胞必需是處于對數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻形狀的單細(xì)胞懸液，將并且是均勻形狀的單細(xì)胞懸液，將121121滅菌滅菌的無菌水參與到培育有鏈霉菌斜面的試管中，的無菌水參與到培育有鏈霉菌斜面的試管中，用接種環(huán)悄然刮下孢子，用接種環(huán)悄然刮下孢子，( (所處置的細(xì)胞必需是處于對所處置的細(xì)胞必需是處于對數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻形狀的單細(xì)胞懸數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻形狀的單細(xì)胞懸液，將含有孢子的無菌水轉(zhuǎn)入三角瓶中，參與玻璃珠，液，將含有孢子的無菌水轉(zhuǎn)入三角瓶中，參

2、與玻璃珠，在搖床上打碎，經(jīng)濾膜過濾后即得到單孢子率在在搖床上打碎，經(jīng)濾膜過濾后即得到單孢子率在9898以以上的單孢子懸液。上的單孢子懸液。目的：在引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時，使存活個體中DNA的構(gòu)造變異頻率大幅度提高。 對誘變劑的敏感性高；對誘變劑的敏感性高； 具有特定消費(fèi)性狀的才干或潛力；具有特定消費(fèi)性狀的才干或潛力； 可采用劃線分別法和稀釋分別法進(jìn)展純化；可采用劃線分別法和稀釋分別法進(jìn)展純化； 該菌株變異幅度廣；該菌株變異幅度廣； 該菌株穩(wěn)定性較好。該菌株穩(wěn)定性較好。 選擇物理誘變劑中非電離輻射即紫外線。選擇物理誘變劑中非電離輻射即紫外線。 由于紫外線是一種運(yùn)用時間長、效果好、由于紫外線是

3、一種運(yùn)用時間長、效果好、設(shè)備簡單、值得推行的誘變劑，大約有設(shè)備簡單、值得推行的誘變劑，大約有80%80%的高產(chǎn)抗的高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌都曾經(jīng)用過紫外線這一誘變方法。生素產(chǎn)生菌都曾經(jīng)用過紫外線這一誘變方法。 紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種 紫外線的作用機(jī)制是使兩個嘧啶之間聚合，構(gòu)成紫外線的作用機(jī)制是使兩個嘧啶之間聚合，構(gòu)成嘧啶二聚體，堿基不能正常配對。嘧啶二聚體，堿基不能正常配對。 紫外線誘變普通采用紫外線誘變普通采用15W15W紫外線殺菌燈，紫外線殺菌燈，波長為波長為253.7nm253.7nm，燈與處置物的間隔為，燈與處置物的間隔為151530cm30cm，照射時間依菌種而異，普通，照射時間依

4、菌種而異，普通為幾秒至幾非常鐘。為幾秒至幾非常鐘。 在誘變育種中有兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線在誘變育種中有兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線: : 劑量劑量- -存活率曲線存活率曲線 劑量劑量- -誘變率曲線誘變率曲線 經(jīng)過比較以上兩曲線，可找到劑量經(jīng)過比較以上兩曲線，可找到劑量- -存活率存活率- -誘變誘變率三者的最正確結(jié)合點(diǎn)。在實(shí)踐任務(wù)中，突變率往往隨率三者的最正確結(jié)合點(diǎn)。在實(shí)踐任務(wù)中，突變率往往隨劑量的添加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量反劑量的添加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量反而會使突變率降低。根據(jù)而會使突變率降低。根據(jù)UVUV、X X射線和乙烯亞胺射線和乙烯亞胺等誘變效應(yīng)研討結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多

5、地出等誘變效應(yīng)研討結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出如今偏低的劑量中，而負(fù)變較多地出如今如今偏低的劑量中，而負(fù)變較多地出如今偏高的劑量中。因此，在誘變?nèi)蝿?wù)中，大偏高的劑量中。因此，在誘變?nèi)蝿?wù)中，大多傾向于采用較低劑量致死率在多傾向于采用較低劑量致死率在70-70-80%80%。 1 1將細(xì)菌培育液以將細(xì)菌培育液以3000r3000rminmin離心離心5min5min，傾去上清液，傾去上清液，參與無菌生理鹽水洗滌再離心。參與無菌生理鹽水洗滌再離心。 2 2將菌懸液放入巳滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手將菌懸液放入巳滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液經(jīng)過濾紙過濾，單細(xì)胞濾液搖動，以打散菌體

6、。將菌液經(jīng)過濾紙過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，使細(xì)胞數(shù)約為裝入試管內(nèi)，使細(xì)胞數(shù)約為108108個個mlml，作為待處置菌懸，作為待處置菌懸液。液。 3 3取取2 24ml4ml制備的菌液加到直徑制備的菌液加到直徑7cm7cm培育皿內(nèi)，放入培育皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W15W紫外線下紫外線下30cm30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外燈預(yù)熱紫外燈預(yù)熱10min10min，然后開啟皿蓋正式在攪拌，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射下照射101050s50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)展，或。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)展，或用黑紙包住

7、，防止白熾光。用黑紙包住，防止白熾光。 4 4取未照射的制備菌液和照射菌液各取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml0.5ml進(jìn)展稀進(jìn)展稀釋分別，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。釋分別，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 5 5取照射菌液取照射菌液2ml2ml于液體培育基中于液體培育基中(300ml(300ml三角瓶三角瓶內(nèi)裝內(nèi)裝30ml30ml培育液培育液) )，120r120rminmin振蕩培育振蕩培育4 46h6h。 6 6取中間培育液稀釋分別、培育。取中間培育液稀釋分別、培育。 7 7挑取菌落進(jìn)展挑選。挑取菌落進(jìn)展挑選。 1 1菌種遺傳特性菌種遺傳特性 各菌株因遺傳特性不同，對誘變劑敏感性也不一各菌株因遺傳特性不同，

8、對誘變劑敏感性也不一 樣。樣。 2 2菌體細(xì)胞壁構(gòu)造菌體細(xì)胞壁構(gòu)造 絲狀菌孢子壁的厚度及外表的蠟質(zhì)會妨礙誘變劑滲絲狀菌孢子壁的厚度及外表的蠟質(zhì)會妨礙誘變劑滲 入細(xì)胞。入細(xì)胞。 3 3環(huán)境條件的影響環(huán)境條件的影響 環(huán)境條件的影響包括：環(huán)境條件的影響包括： 誘變前預(yù)培育和誘變后培育誘變前預(yù)培育和誘變后培育 溫度、溫度、pHpH、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響 由接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分別的資料，由接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分別的資料，在無菌平板外表進(jìn)展平行劃線、扇形劃線或其在無菌平板外表進(jìn)展平行劃線、扇形劃線或其他方式的延續(xù)劃線，使鏈霉菌細(xì)胞數(shù)量將隨著他方式的延

9、續(xù)劃線，使鏈霉菌細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的添加而減少，并逐漸分散開來。假劃線次數(shù)的添加而減少，并逐漸分散開來。假設(shè)劃線適宜的話，能將鏈霉菌細(xì)胞一一分散，設(shè)劃線適宜的話，能將鏈霉菌細(xì)胞一一分散，經(jīng)培育后，可在平板外表得到單菌落。并測定經(jīng)培育后，可在平板外表得到單菌落。并測定出其變異率變異數(shù)與察看總個體數(shù)的比值。出其變異率變異數(shù)與察看總個體數(shù)的比值。挑出變異菌落并移植至斜面上。挑出變異菌落并移植至斜面上。 分別后得到的菌落，真正能發(fā)生性能變好的所謂正突分別后得到的菌落，真正能發(fā)生性能變好的所謂正突變個數(shù)極少，要從幾千萬個菌落中選出幾個好的，與變個數(shù)極少，要從幾千萬個菌落中選出幾個好的，與自然選育中的

10、挑選方法一樣?？煞譃槌鹾Y平板挑選、自然選育中的挑選方法一樣?？煞譃槌鹾Y平板挑選、搖瓶發(fā)酵挑選搖瓶發(fā)酵挑選) )和復(fù)篩。和復(fù)篩。 挑選的方法：隨機(jī)亂向挑選挑選的方法：隨機(jī)亂向挑選 定向挑選定向挑選 突變是隨機(jī)不定向的，但是挑選是定向的，培育基和突變是隨機(jī)不定向的，但是挑選是定向的，培育基和培育條件是決議菌種某些特性保管或淘汰的培育條件是決議菌種某些特性保管或淘汰的“篩子。篩子。 初篩：以多為主，盡量擴(kuò)展挑選范圍。初篩：以多為主，盡量擴(kuò)展挑選范圍。 復(fù)篩：以質(zhì)和精為主，反復(fù)多次，結(jié)合自然分別，復(fù)篩：以質(zhì)和精為主，反復(fù)多次，結(jié)合自然分別，選育高產(chǎn)或其他優(yōu)良菌株。選育高產(chǎn)或其他優(yōu)良菌株。 多級程度挑選

11、：由于誘變產(chǎn)生高產(chǎn)突變株的頻率很多級程度挑選：由于誘變產(chǎn)生高產(chǎn)突變株的頻率很低，而且實(shí)、驗(yàn)誤差又很難防止，所以挑選任務(wù)中低，而且實(shí)、驗(yàn)誤差又很難防止，所以挑選任務(wù)中常用多級挑選，一利于優(yōu)良菌株的獲得常用多級挑選，一利于優(yōu)良菌株的獲得 平板菌落預(yù)篩平板菌落預(yù)篩 根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，利用瓊脂平板進(jìn)展根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，利用瓊脂平板進(jìn)展挑選和活性粗測的方法，大幅度擴(kuò)展有效挑選量，提挑選和活性粗測的方法，大幅度擴(kuò)展有效挑選量，提高挑選任務(wù)效率。高挑選任務(wù)效率。 搖瓶發(fā)酵挑選搖瓶發(fā)酵挑選 優(yōu)點(diǎn)：不論種子或發(fā)酵過程的消費(fèi)條件、生理?xiàng)l優(yōu)點(diǎn)：不論種子或發(fā)酵過程的消費(fèi)條件、生理?xiàng)l件如何，都與發(fā)酵罐大

12、消費(fèi)條件相近，可以模擬進(jìn)展。件如何，都與發(fā)酵罐大消費(fèi)條件相近，可以模擬進(jìn)展。缺陷：在突變率小的情況下，假設(shè)菌落挑缺陷：在突變率小的情況下，假設(shè)菌落挑取少，很難挑選到理想的突變株取少，很難挑選到理想的突變株 對初篩出來的菌株進(jìn)展復(fù)篩時，通常采用搖瓶培對初篩出來的菌株進(jìn)展復(fù)篩時，通常采用搖瓶培育法，普通一個菌株至少要反復(fù)育法，普通一個菌株至少要反復(fù)3535個瓶，培育后個瓶，培育后的發(fā)酵液必需采用準(zhǔn)確分析方法測定。的發(fā)酵液必需采用準(zhǔn)確分析方法測定。 復(fù)篩過程中，要結(jié)合各種培育條件進(jìn)復(fù)篩過程中，要結(jié)合各種培育條件進(jìn)展挑選，在不同培育條件下進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。展挑選，在不同培育條件下進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。 1 1、步驟：搖瓶

13、培育通常分為初篩和復(fù)篩，初篩因菌、步驟：搖瓶培育通常分為初篩和復(fù)篩，初篩因菌株多經(jīng)常一株菌一瓶，進(jìn)展振蕩培育，培育終了后逐株多經(jīng)常一株菌一瓶，進(jìn)展振蕩培育，培育終了后逐個進(jìn)展活性測定，將消費(fèi)性能高的菌株用沙土管或冷個進(jìn)展活性測定，將消費(fèi)性能高的菌株用沙土管或冷凍管保藏。復(fù)篩時取出，以一株凍管保藏。復(fù)篩時取出，以一株3-53-5瓶，振蕩培育后，瓶，振蕩培育后，測定活性，以提高準(zhǔn)確性。測定活性，以提高準(zhǔn)確性。 2 2、優(yōu)點(diǎn)：培育條件與發(fā)酵罐接近，這樣挑選出來的、優(yōu)點(diǎn)：培育條件與發(fā)酵罐接近，這樣挑選出來的菌容易在大消費(fèi)中推行。菌容易在大消費(fèi)中推行。3 3、本卷須知：搖瓶的條件要盡量與發(fā)、本卷須知：搖

14、瓶的條件要盡量與發(fā)酵罐接近。且各搖瓶間的培育條件要盡酵罐接近。且各搖瓶間的培育條件要盡量一致?lián)u瓶型號，裝量，瓶塞厚度或量一致?lián)u瓶型號，裝量，瓶塞厚度或瓶口包扎紗布的層數(shù)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)，溫度瓶口包扎紗布的層數(shù)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)，溫度培育基脂肪酶脂肪酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌透明圈法透明圈法成色圈法成色圈法果膠酶果膠酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌生長圈法生長圈法抑菌圈法抑菌圈法嘌呤產(chǎn)生菌嘌呤產(chǎn)生菌青霉素青霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌一、根據(jù)平板菌落生化反響挑一、根據(jù)平板菌落生化反響挑選變株選變株2037二、采用冷敏感菌挑選抗生素變株二、采用冷敏感菌挑選抗生素變株參與抗生素參與抗生素不加抗生素不加抗生素三、濃度梯度法挑選法三、濃度梯度法挑選法四、復(fù)印

15、技術(shù)快速挑選變株四、復(fù)印技術(shù)快速挑選變株測定不同酵母菌胞內(nèi)脂肪含量的簡單定量法測定不同酵母菌胞內(nèi)脂肪含量的簡單定量法蘇丹黑染色1五、瓊脂大通量挑選變株五、瓊脂大通量挑選變株200搖瓶液體培育寥寥無幾產(chǎn)物活性鑒定培育基培育條件調(diào)整正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1. 1.瓊脂平板活性圈法瓊脂平板活性圈法 2. 2.紙片法紙片法: :發(fā)酵液濃度高時發(fā)酵液濃度高時 3. 3.瓊脂薄層紙片法瓊脂薄層紙片法 4. 4.自動生化儀器分析法自動生化儀器分析法透明圈透明圈變色圈變色圈生長圈生長圈抑菌圈抑菌圈( (水解酶、水解酶、有機(jī)酸有機(jī)酸 ( (產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸菌) )(工具菌+待檢菌)( (抗生菌抗生菌) ) 本組方案采用瓊脂平

16、板活性圈法中的抑菌圈來測定其活性。 與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體 野生型菌株野生型菌株wild type strain wild type strain 原始菌株原始菌株 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型auxotroph auxotroph 人工誘變或自然突變?nèi)斯ふT變或自然突變 原養(yǎng)型菌株原養(yǎng)型菌株prototroph prototroph 回復(fù)突變或重組變異回復(fù)突變或重組變異 與挑選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)三類培育基與挑選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)三類培育基 (1)(1)根本培育基根本培育基MMMM (2)(2)完全培育基完全培育基CMCM (3)(3)補(bǔ)充培育基補(bǔ)充培育基SMSM突

17、變株的表型 檢出方法營養(yǎng)缺陷型 補(bǔ)充培育基auxotroph 抗性突變型 藥物培育基resistant mutant條件致死型 培育條件改動conditional lethal mutant 誘發(fā)突變誘發(fā)突變 淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株 檢出缺陷性檢出缺陷性 鑒別缺陷性鑒別缺陷性 選擇適宜的誘變劑與誘變方法選擇適宜的誘變劑與誘變方法 誘變劑和誘變方法都要簡便有效誘變劑和誘變方法都要簡便有效 主要的誘變劑亞硝基胍主要的誘變劑亞硝基胍, ,紫外線紫外線, ,亞硝酸亞硝酸 誘變方法誘變方法 物理方法物理方法 化學(xué)方法化學(xué)方法 留意突變率還與誘變劑量有關(guān)留意突變率還與誘變劑量有關(guān) 1.抗生素法 青霉

18、素法細(xì)菌 作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖 制霉菌法酵母菌 作用于真菌細(xì)胞膜上的甾醇 2.菌絲過濾法 適用于真菌和放線菌 作用于絲狀菌的孢子 3.高溫殺菌法 適用于芽孢菌類 作用于芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)體 夾 層 培 育 法 夾 層 培 育 法 限量補(bǔ)充培育限量補(bǔ)充培育法法 影 印 接 種 法影 印 接 種 法 逐個檢出法逐個檢出法 需求留意兩點(diǎn) 第一 防止菌落分散和蔓延，在培育基中參與脫氧膽酸鈉 第二 為了抑制孢子分散而帶來不純景象，在操作方法上改良。 1 、鑒定方法 一種方法是參與一種物質(zhì)測定多株缺陷型菌株 一種方法是測定一種缺陷型菌株對許多生長因子的需求情況稱為生長譜法 2、營養(yǎng)缺陷型鑒定步驟 1測定缺陷性菌株所需生長因子的類別 2詳細(xì)測缺陷該類別物質(zhì)中的哪種因子 3用單一因子進(jìn)展復(fù)證實(shí)驗(yàn) 營養(yǎng)缺陷型生長