實驗七、熒光顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡使用ppt課件

1、實驗七實驗七-1細胞熒光染色觀察與熒光顯微細胞熒光染色觀察與熒光顯微鏡的使用鏡的使用（示范：細胞形態(tài)觀察與暗視（示范：細胞形態(tài)觀察與暗視野顯微鏡的使用）野顯微鏡的使用）實驗?zāi)康呐c教學(xué)要求實驗?zāi)康呐c教學(xué)要求n掌握熒光顯微鏡的成像基本原理及掌握熒光顯微鏡的成像基本原理及其使用；其使用；n掌握暗視野顯微鏡的成像基本原理掌握暗視野顯微鏡的成像基本原理及其使用。及其使用。熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光

2、，從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。一、熒光顯微鏡的成像原理一、熒光顯微鏡的成像原理什么是熒光什么是熒光 ? ?n物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。放出的光。n即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。保持固有的熒光特性保持固有的熒光特性熒光波長激發(fā)波長熒光波長激發(fā)波長熒光強度極小于激發(fā)光的強度熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒

3、光效率熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質(zhì)熒光的性質(zhì)優(yōu)點：優(yōu)點：檢出能力高檢出能力高對細胞的刺激小對細胞的刺激小能進行多重染色能進行多重染色用途：用途：物體構(gòu)造的觀察物體構(gòu)造的觀察熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途熒光素熒光素激發(fā)波長激發(fā)波長 發(fā)射波長發(fā)射波長DAPI372372456456AMCA350350450450Hoechst 33258365365465465FITC490490520520Acridine Orange4

4、90490590590Acridine Yellow470470550550CY3552552565565TRITC541541572572Propidium Iodide530530615615對細胞結(jié)構(gòu)或組分的定性、定位、半對細胞結(jié)構(gòu)或組分的定性、定位、半定量研究。定量研究。作為生物大分子篩選與鑒定的標記物。作為生物大分子篩選與鑒定的標記物。熒光顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用熒光顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用二、暗視野顯微鏡的成像原理二、暗視野顯微鏡的成像原理通過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改通過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改變途徑，不直接進入物鏡，而是傾斜地照變途徑，不直接進入物

5、鏡，而是傾斜地照射到樣品上，由樣品表面的繞射光線入射射到樣品上，由樣品表面的繞射光線入射到物鏡內(nèi)，產(chǎn)生樣品的衍射圖象。到物鏡內(nèi)，產(chǎn)生樣品的衍射圖象。三、試劑與器材三、試劑與器材青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片HE染色）染色）甲醇、甲醇、1 丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡四、實驗內(nèi)容和實驗步驟四、實驗內(nèi)容和實驗步驟蛙血細胞染色觀察：取少許蛙血蛙血細胞染色觀察：取少許蛙血 常規(guī)血涂片常規(guī)血涂片 涼干涼干 甲醇固定甲醇固定10 min 1 丫啶

6、橙染色丫啶橙染色5 min 水洗水洗 室室溫干燥濾紙擦干玻片底面）溫干燥濾紙擦干玻片底面） 熒光顯微鏡觀察先低倍熒光顯微鏡觀察先低倍后高倍觀察）后高倍觀察） （可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細胞）（可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細胞）取洋蔥取洋蔥撕取一小片內(nèi)表皮撕取一小片內(nèi)表皮平面單層鋪展于玻片上平面單層鋪展于玻片上室溫室溫涼干涼干1丫啶橙染色丫啶橙染色5min 水洗用吸管，小心掉片）水洗用吸管，小心掉片） 室溫干燥或用濾紙擦干）室溫干燥或用濾紙擦干） 熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡觀察暗視野顯微鏡觀察蛙血細胞示范）暗視野顯微鏡觀察蛙血細胞示范）觀察人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片觀察人正常肝組

7、織切片和脂肪肝組織切片HE染色）染色）n 熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。察。n 使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察激發(fā)光源，保護眼睛。激發(fā)光源，保護眼睛。n 暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。觀察。 五、本卷須知五、本卷須知六、作業(yè)與思考題：六、作業(yè)與思考題：描述在熒光顯微鏡下所觀察到描述在熒光顯微鏡下所觀察到的實驗現(xiàn)象。的實驗現(xiàn)象。繪圖比較人正常肝組織細胞和繪圖比較人正常肝組織細胞和脂肪肝組織細胞。脂肪肝組織細胞。實驗七實驗七-2 激光掃描共聚焦顯微鏡在生命科學(xué)中的激光掃描共聚

8、焦顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用應(yīng)用 實驗?zāi)康呐c要求實驗?zāi)康呐c要求1. 掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用。原理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用。Laser Scanning Confocal Microscope普通熒光顯微鏡的不足普通熒光顯微鏡的不足 使用熒光物質(zhì)標記細胞中的特定成分或結(jié)構(gòu)，使用熒光物質(zhì)標記細胞中的特定成分或結(jié)構(gòu)，不僅圖像與對比度增強，而且由于許多熒光顯不僅圖像與對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辯率分辯率=0.61 / NA ）。但當所觀察的熒光標）。

9、但當所觀察的熒光標本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低即焦使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。數(shù)生物學(xué)標本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理2. 共聚焦掃描顯微鏡的成像原理共聚焦

10、掃描顯微鏡的成像原理采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系焦平面上的

11、光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像

12、。聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。Confocal Principle每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學(xué)橫切面，每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學(xué)橫切面，這個光學(xué)橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)這個光學(xué)橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學(xué)斷軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把切片。把

13、X-Y平面焦平面掃描與平面焦平面掃描與Z軸光軸軸光軸掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。圖像。觀察方式：以熒光為主觀察方式：以熒光為主光源：激光紫外、可見光、近紅外）光源：激光紫外、可見光、近紅外）照明方式：點照明、逐點掃描照明方式：點照明、逐點掃描成像方式：共聚焦、逐點成像成像方式：共聚焦、逐點成像輸出：實時觀測輸出：實時觀測,數(shù)字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析數(shù)字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察多重染色樣品的觀察LSCM的基本特點

14、3. 共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)如受體、抗原、抗體、酶、細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)如受體、抗原、抗體、酶、細胞細胞骨架蛋白等基因表達產(chǎn)物）、骨架蛋白等基因表達產(chǎn)物）、DNA、RNA等等細胞膜流動性熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)）細胞膜流動性熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)）細胞內(nèi)氧自由基活性細胞內(nèi)氧自由基活性細胞內(nèi)鈣離子濃度變化細胞內(nèi)鈣離子濃度變化膜電位膜電位三、試劑與器材三、試劑與器材青蛙青蛙冷丙酮、冷丙酮、 DAPI 、甘油、甘油/PBS封片劑、濾紙、吸管、載封片劑、濾紙、吸管、載玻片、蓋玻片玻片、蓋玻片激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡四、實驗步驟四、實驗步驟取涂有細胞的載玻片細胞涂在中間），冷丙取涂有細胞的載玻片細胞涂在中間），冷丙酮酮40C固定固定10 min;PBS漂洗漂洗2次，每次次，每次3 min; 滴加滴加DAPI溶液溶液100 ul室溫孵育室溫孵育30 min; PBS漂洗漂洗3次，每次次，每次5min; 滴一小滴甘油滴一小滴甘油/PBS封片劑封片劑(pH8.5，PBS:甘油甘油=1:9，v/v)封片封