abi公司非常專業(yè)的定量pcr培訓(xùn)故障排除

1、定量PCRv：故障排除-407，chenyd2004年1內(nèi)容提要v 實(shí)時(shí)定量故障v SNP鑒定故障2到哪里找線索？數(shù)據(jù)分析：牢記OBTExclude Outlying wells (wells that have failed)Exclude any samples with atypical plots or that “creep”, i.e. that do not exhibit bona-fide amplification (have 3 points in log phase). This may include NTCs that creep up over the thres

2、hold at 40 cycles.O:Set BaselineDefault is 3 to 15, but set it to cover as many cycles as possible (typically 1-2 cycles before the reporter dye signal begins to increase).B:Set ThresholdSet halfway point in the log part of the amplification plot. Use semi-log scale (makes the log phase of the PCR c

3、lear). A threshold for a particular assay can be set to the same value from run-to-run.T:Check instrument settings! (for 7700 only)For example, if multiplexing (Fam + Vic) select the checkbox “Use Spectral Compensation for Real Time” and re-analyse.Also:4擴(kuò)增曲線5原始數(shù)據(jù)能提供大量線索6TAMRAROXFAM各波長(zhǎng)的原始信號(hào)7ROXTAMRA

4、VICFAM實(shí)時(shí)定量故障有數(shù)據(jù)沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線9有數(shù)據(jù)沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線10擴(kuò)增曲線斷成兩段Possible Cause:基線范圍過大，包含部分?jǐn)U增信號(hào)，致使閾值偏高如：CT值 10000點(diǎn)，就打折弱的信號(hào)經(jīng)過校正后，點(diǎn)與點(diǎn)之間的差異被放大凈高4000點(diǎn)Rn= FAMROX13凈高26000點(diǎn)解決1關(guān) 閉校 正 7000 SDS升級(jí)到v1.1 使用高質(zhì)量的探針 關(guān)閉ROX校正同一樣品去掉ROX校正后15擴(kuò)增曲線不是S形16探針降解ROX反應(yīng)故障為什么重復(fù)性這么差？17ROX反應(yīng)故障正常的原始數(shù)據(jù)18ROX反應(yīng)故障蓋子未蓋緊，溶液蒸發(fā)19ROX去掉蒸發(fā)反應(yīng)故障的數(shù)據(jù)，重復(fù)性很好20引物二聚體SYBR Gr

5、een I chemistry，dissociation curve analysis*Check whether the nonspecific product is primer dimerIf the nonspecific product is primer dimer，try optimization of the primer concentration*21PCR Stage Auto-Compute Error7700 SDS v1.7問題:結(jié)果分析後出現(xiàn)以下a.Amplification Plot中沒有數(shù)據(jù)根據(jù)Plate窗口每孔的亮點(diǎn)有反應(yīng)Amplification Plot

6、的X軸(cycle)只顯示0到1無法關(guān)閉視窗b.c.0122No Ct value, but “INF”PCR Stage Auto-Compute Error7700 SDS v1.7:可能軟件自動(dòng)分析時(shí)無法確定PCR stage和Extension Step23PCR Stage Auto-Compute Error7700 SDS v1.7:解決a. 關(guān)閉分析視窗:在Use Threshold, Baseline Start, Baseline Stop中輸入0, 然後Update Calculation即可將視窗關(guān)閉b. 數(shù)據(jù)分析人工指定信號(hào)收集點(diǎn) (stage 3, Step 2)

7、， 重新計(jì)算c.7000、7900、7300、7500均能自動(dòng)找到信號(hào)收集點(diǎn) (stage 3, Step 2)，不需手工設(shè)定24SNP鑒定故障結(jié)果，三種基因型很清楚，個(gè)別散點(diǎn)是因?yàn)镈NA純度、用量、罕見突變等缺點(diǎn)： 沒有對(duì)照（NTC）沒有陽性對(duì)照（3種等位基因）建議：每板增加NTC、純合子1、純合子2和雜合子各3個(gè)，以可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)問題。全部雜合子：兩條探針在基因組里都有同源序列（如假基因等），導(dǎo)致兩種信號(hào)始終同時(shí)出現(xiàn)，形成雜合子的假象。其他已知基因型的對(duì)照或者人工混合的對(duì)照樣品BLAST，檢查序列數(shù)據(jù)庫FAM純合子缺失模板上還有VIC探針的同源序列BLAST檢查基因數(shù)據(jù)庫VIC純合子缺失經(jīng)過計(jì)算，三種基因型的比例是300：30：1， 結(jié)果可以接受。信號(hào)分得不好，與反應(yīng)體系沒有最優(yōu)化有關(guān)。VIC信號(hào)太弱1。VIC探針降解（光、溫度、緩沖液等影響其的因素）2。VIC反應(yīng)條件不佳（溫度、濃度等）。信號(hào)連續(xù)DNA濃度差別較大加樣體積差別大槍的誤差管底沾有灰塵用吹風(fēng)機(jī)吹反應(yīng)失敗32同一位點(diǎn)第二次重復(fù)實(shí)驗(yàn)完全正常， 可能是操作問題。9個(gè)數(shù)量級(jí)1倍分辨率 !熔解曲