gbt23788-2009_保健食品中大豆異黃酮的測定_高效液相色譜法

1、GB/T 23788-2009保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法1 范圍本標準規(guī)定了保健食品中大豆異黃酮的測定方法。本標準適用于以大豆異黃酮為主要功能性成分的保健食品（片劑、膠囊、口服液、飲料），也可用于保健食品原料中大豆異黃酮含量的測定。本標準的檢出限：固體、半固體樣品大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素組分的檢出限均為5mg/kg；液體樣品的大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素組分的檢出限均為0.2mg/L。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂

2、版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，起最新版本適用于本標準。GB/T6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法（GB/T66822008，ISO 3696；1987，MOD）3 術語和定義下列術語和定義適用于本標準。4 方法提要樣品制備、提取、過濾后，經高效液相色譜儀分析（C18柱分離），一句保留時間定性，用外標法定量。5 試劑和材料本標準使用符合GB/T6682規(guī)定的一級水，除另有規(guī)定僅使用分析純試劑。5.1 乙腈：色譜純。5.2 甲醇：優(yōu)級純。5.3 80%甲醇：用甲醇80mL，加水20mL，混勻。5.4 磷酸。5.5

3、 磷酸水溶液：用磷酸調節(jié)pH至3.0，經0.45um濾膜過濾。5.6 二甲基亞砜：色譜純。5.7 50%二甲基亞砜溶液：取二甲基亞砜50mL，加水50mL，混勻。5.8 大豆異黃酮標準貯備溶液：稱取大豆苷、大豆黃苷和染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素（純度均為98.0%以上）各4mg，分別置于10mL的容量瓶中，加入二甲基亞砜（5.6）至接近刻度，超聲處理30min，再用二甲基亞砜（5.6）定容，各標準貯備溶液濃度均為400mg/L（大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素）。5.9 大豆異黃酮混合標準使用溶液：8.0mg/L混合標準溶液配制：吸取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大

4、豆素、大豆黃素和染料木素六種標準貯備溶液（5.8）各0.2mL于10mL容量瓶中，加入等體積水，用50%二甲基亞砜溶液（5.7）定容。16.0mg/L混合標準溶液配制：吸取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素六種標準貯備溶液（5.8）各0.4mL于10mL容量瓶中，加入等體積水，用50%二甲基亞砜溶液（5.7）定容。24.0mg/L混合標準溶液配制：吸取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素六種標準貯備溶液（5.8）各0.6mL于10mL容量瓶中，加入等體積水，用50%二甲基亞砜溶液（5.7）定容。32.0mg/L混合標準溶液配制：吸取大豆苷、大豆黃苷、染料木

5、苷、大豆素、大豆黃素和染料木素六種標準貯備溶液（5.8）各0.8mL于10mL容量瓶中，加入等體積水，用50%二甲基亞砜溶液（5.7）定容。40.0mg/L混合標準溶液配制：吸取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素六種標準貯備溶液（5.8）各1.0mL于10mL容量瓶中，加入等體積水，用50%二甲基亞砜溶液（5.7）定容。6 儀器和設備6.1 高效液相色譜儀：帶紫外檢測器（或二級管陣列檢測器）。6.2 超聲波振蕩器。6.3 分析天平，感量0.01mg。6.4 酸度計：精度0.02pH。6.5 離心機：轉速不低于8000r/min。6.6 濾膜：孔徑為0.45um。6.7 容量

6、瓶：10mL。7 分析步驟7.1 樣品處理7.1.1 固體樣品、半固體樣品：固體樣品粉碎、磨細（過80目篩）、混勻，半固體樣品混勻，稱取樣品0.05g0.5g（精確至0.1mg），用80%甲醇溶液（5.3）溶解并轉移至50mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液至接近刻度。7.1.2 液體樣品：吸取混勻的液體樣品0.5mL5.0mL于50mL容量瓶中，加入甲醇溶液至接近刻度。7.1.3 將上述樣品溶液（7.1.1或7.1.2）用超聲波振蕩器振蕩20min，用80%甲醇定容，搖勻。取樣品溶液置于離心管中，離心機離心15min（轉速大于8000r/min）。取上清液用濾膜（6.6）過濾，手機濾液備用。7.

7、2 色譜條件7.2.1 色譜柱C18,4.6mm×250mm，粒度5m 不銹鋼色譜柱，也可使用分離效果相當的其他不銹鋼柱。7.2.2 流動相流動相 A：乙腈（5.1）。流動相 B：磷酸水溶液（pH=3.0）（5.5）。7.2.3 梯度洗脫條件見表1。時間/min010233050555660流動相A/%1218243030801212流動相B/%88827670702088887.2.4 流速：1.0mL/min。7.2.5 波長：260nm。7.2.6 進樣量：10L。7.2.7 柱溫：30。7.3 測定7.3.1 定性分別將大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素的

8、標準貯備溶液（5.8）稀釋10倍后，按色譜條件（7.2）進行測定，依據單一標準樣品的保留時間，對樣品溶液中的組分進行定性，定性色譜圖參見附錄A。7.3.2 定量將大豆異黃酮混合標準使用溶液（5.9）在色譜條件（7.2）下進行測定，繪制以峰面積為縱坐標、混合標準使用溶液濃度為橫坐標的標準曲線。將7.1.3制備的樣品溶液注入高效液相色譜儀中，保證樣品溶液中大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素的響應值均在工作曲線的線性范圍內，由標準曲線差得樣品溶液中大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素的濃度。8 結果計算8.1 樣品中大豆異黃酮各組分大豆苷（X1）、大豆黃苷（X2

9、）、染料木苷（X3）、大豆素（X4）、大豆黃素（X5）和染料木素（X6）的含量分別按式（1）計算：式中：Xi樣品中大豆異黃酮單一組分的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；Ci根據標準曲線得出的大豆苷（或大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素）的濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V樣品稀釋液總體積的數值，單位為毫升（mL）；m固體、半固體楊南平質量的數值，單位為克（g）； 液體樣品體積的數值，單位為毫升（mL）。8.2 樣品中大豆異黃酮總含量，按式（2）計算：X= X1+X2+X3+X4+X5+X6 （2）式中：X樣品中大豆異黃酮總含量，單位為毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；X1樣品中大豆苷的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；X2樣品中大豆黃苷的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；X3樣品中染料木苷的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；X4樣品中大豆素的含量，單位為毫克每千克（m