Western試劑配制和操作步驟

1、Western（試劑配制和操作步驟）試劑配制：（一）母液  （二）使用液 操作步驟：（一） 蛋白樣品制備 （二） 蛋白含量的測定 （三） SDSPAGE電泳 （四）轉(zhuǎn)膜 （五）免疫反應(yīng) （六）化學(xué)發(fā)光，顯影，定影 （七） 凝膠圖象分析這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。 Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對非放射性標(biāo)記蛋白組成

2、的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進行鑒別和鑒定。耗材： 硝酸纖維素膜，乳膠手套，保鮮膜，搪瓷盤（>20×20cm），X-光片夾，X-光片，玻棒長短各一根，計時器，吸水紙，試劑配制：（一）母液1.0mol/L TrisHCl            Tris (MW121.14)          30.29g      

3、0;      蒸餾水                 200ml   溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。                 

4、;   PH           HCl                    7.4         約17ml        

5、            7.5         約16m                    7.6         約15ml 

6、;                   8.0        約10ml10SDS             SDS         

7、0;        10g           蒸餾水至               100ml50水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10過硫酸胺（AP）        

8、60;         過硫酸胺             0.1g                  超純水          &

9、#160;     1.0ml溶解后，4保存，保存時間為1周。1.5mol/L TrisHCl（pH8.8）                  Tris (MW121.14)         45.43g         

10、0;         超純水                         200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。0.5mol/L TrisHCl（pH6.8）     &

11、#160;             Tris (MW121.14)         15.14g                   超純水      

12、;                    200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。20Tween20Tween20          20ml 蒸餾水至         100ml混勻后

13、4保存。（二）使用液單去污劑裂解液（50mmol/L TrisHCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100?g/ml PMSF）： 1mol/L TrisHCl（pH8.0）  2.5mlNaCl                              

14、;         0.438gTritonX100                       0.5ml蒸餾水至                &

15、#160;             50ml                  混勻后， 4保存。使用時，加入PMSF至終濃度為100?g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。0.01mol/L PBS（）NaCl    

16、0;                             8.0gKCl 0.2gNa2HPO4  1.44g (Na2HPO4 .H2O 1.56g Na2HPO4 .12H2O 3.58g)KH2PO4 0.2g蒸餾水至      

17、                   1000mlG250考馬斯亮藍溶液（測蛋白含量專用）                  考馬斯亮藍G250：  100mg      

18、0;           95乙醇：         50ml                  磷酸：            

19、100ml                  蒸餾水至           1000ml 配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4保存。0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44）   0.877g 蒸餾水至    

20、60;     100 ml高溫滅菌后，室溫保存。100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA                   0.1g 0.15 mol/L NaCl   1ml溶解后，20保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時，用0.15 mol/LNaCl進行100倍稀釋成1mg/ml，20保存。10分離膠和5濃縮校10分離膠（兩塊膠，10ml） 

21、       5濃縮膠（兩塊膠，5ml）10%AP（過硫酸胺）                          TEMED              

22、;                          加 TEMED后，立即混勻即可灌膠。還原型5XSDS上樣緩沖液（0.25mol/L Tris?HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10 SDS，0.5溴酚藍，50甘油）0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8）     

23、;         2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）    0.39gSDS                                  &

24、#160;                      0.5g溴酚藍                           

25、0;                        0.025甘油                          &

26、#160;                             2.5ml混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4保存。電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1 SDS）Tris（MW121.14）        &

27、#160;   3.03g甘氨酸（MW75.07）        18.77gSDS                                   

28、60;   1g蒸餾水至                             1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35 次。轉(zhuǎn)移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037 SDS，20甲醇）半干轉(zhuǎn)1X電轉(zhuǎn)液：甘氨酸（MW75.07）   &

29、#160;    2.9gTris（MW121.14）          5.8g  SDS                               

30、60;   0.37g  甲醇                                  200ml蒸餾水至          &#

31、160;               1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35次。濕轉(zhuǎn)1X電轉(zhuǎn)液：甘氨酸（MW75.07）        11.25gTris（MW121.14）          2.375g  SDS      

32、                             0.375g  甲醇                  

33、60;               200ml蒸餾水至                          1000ml溶解后4保存，次溶液可重復(fù)使用35次。TBS緩沖液（100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150m

34、mol/L NaCl）1 mol/ LTrisHCl（pH7.5）  10mlNaCl                         8.8g蒸餾水至                 1000ml&

35、#160;TBST緩沖液（含 0.05Tween20的TBS緩沖液） 20Tween20        1.65mlTBS                       700ml混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。封閉液（含5脫脂奶粉的TBST緩沖液）脫脂奶粉（國產(chǎn)，安怡牌）    &

36、#160;     5g TBST                                           100ml

37、溶解后4保存。使用時，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。洗脫抗體緩沖液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2SDS，62.5m mol/L TrisHCl pH6.8）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巰基乙醇)     700 ml （通風(fēng)廚里加）               SDS     

38、60;                                                 2g  

39、;       0.5mol/L TrisHCl（pH6.8）                 12.5ml            超純水至           

40、;                                   100ml配制時，在通風(fēng)廚內(nèi)進行。 4保存?？芍貜?fù)使用1次。10X麗春紅染液麗春紅S          2g三氯乙酸&

41、#160;       30g磺基水楊酸      30g蒸餾水至       100ml使用時將其稀釋10倍。顯影液：H2O 365ml A 125ml B 5.1ml C 4.875ml4保存。定影液H2O 363.5ml A 125ml4保存。抗體 用TBST稀釋至一定濃度使用，每張膜需0.5ml化學(xué)發(fā)光試劑購自北京中山公司，為Santa Cruz產(chǎn)品，分A和B兩種試劑。操作步驟SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜封閉一抗顯色或化學(xué)發(fā)光

42、顯影二抗蛋白樣品制備洗膜（一） 蛋白樣品制備（1）貼壁細胞總蛋白的提?。海ㄕ麄€操作盡量在冰上進行）收集細胞，加裂解液100ul漩渦混勻，冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。在4下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20保存。（二） 蛋白含量的測定（1） 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1、 從20取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2、 取適量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)稀釋至終濃度0.5 mg/ml ；按照下表將0.5mg/ml BSA和稀釋液PBS加到96孔板中，并取樣品2ul加入96孔板中，加PBS至20ul.（樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)置復(fù)孔）3、 按A:B=50:1配制

43、適量的BCA工作液，混勻，室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。各孔加入200ulBCA工作液37°30min測定A562，求平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。編號123456780.5mg/ml BSA(ul)01248121620PBS(ul)2019181612840得到標(biāo)準(zhǔn)BSA濃度(ugul)00.0250.050.10.20.30.40.5（三） SDSPAGE電泳電泳時間一般為23h，電壓為80V 30min;120V 3h較好，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。SDS-PAGE 分離膠濃度最佳分離范圍6%50-150kD8%30-90kD10%20-80kD12%12-60kD15%10-4

44、0kD¶ 配制10%的過硫酸銨¶ 配制12%分離膠（5ml)¶ 待膠灌至距離玻璃板頂端1.5cm的時候停止灌膠，加入蒸餾水¶ 聚合40分鐘后，倒掉蒸餾水¶ 配制5%濃縮膠（2ml）灌濃縮膠¶ 插上梳子，聚合20分鐘¶ 注意：灌膠過程中避免產(chǎn)生氣泡（四）轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜詳細操作過程：（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.08.0cm的濾紙和1張7.38.6cm的PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF膜則在M-OH中浸泡10min以上后轉(zhuǎn)入TBS液中平衡。將濾紙浸入TBS液中潤濕。（2）在加有轉(zhuǎn)膜液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)

45、膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。（3）將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。（4）要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。輕輕劃開分離膠與玻板左右兩邊的接觸面，不然取膠時容易弄破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊

46、，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠并除氣泡（膜蓋下后不可再移動）。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)膜液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。注意膜在正極+側(cè)，分離膠在負極-側(cè)。標(biāo)記正反面。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。濕轉(zhuǎn)一般用400mA轉(zhuǎn)移1:30 h，根據(jù)分子量大小調(diào)整。轉(zhuǎn)移方法的選擇：v 半干轉(zhuǎn) ü 用濾紙吸buffer來做轉(zhuǎn)移體系的轉(zhuǎn)移方法；ü 適合轉(zhuǎn)移小分子量的蛋白；ü 半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來算的，時間是根據(jù)蛋白分子大小定的；ü 1.2-2MA/CM2 1h v 濕轉(zhuǎn)ü 將膜、膠、濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的方法；ü 適合轉(zhuǎn)移大分子量（100KD以上）蛋白；ü 濕轉(zhuǎn)電流是恒定的，時間也是根據(jù)分子量而定；ü 300mA 1h（五）免疫反應(yīng)（1）封閉：轉(zhuǎn)完后將膜用去離子水或TBST從下向上浸濕后吸干，將膜在含5%脫脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Twe