復(fù)方鮮竹瀝液微生物限度檢查法的方法學(xué)研究試驗(yàn)資料

1、腦心舒口服液微生物限度檢查法的方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)資料1目的 對(duì)供試品進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，確認(rèn)所采用的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法是否適合于該藥品的微生物限度檢查。本試驗(yàn)依據(jù)中國(guó)藥典2010年版一部附錄 C對(duì)其進(jìn)行了微生物限度檢查法的研究并驗(yàn)證，建立了該品種的微生物限度檢查的方法。2樣品：腦心舒口服液 批 號(hào)：規(guī)格： 生產(chǎn)單位： 3實(shí)驗(yàn)儀器：高壓蒸汽立式滅菌器LMQ.C 山東新華醫(yī)療器械公司微波爐 SANYO EM-311EB1 合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司電子天平 Sartorius BP2114 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司凈化工作臺(tái) JB-CJ-2FQ 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有

2、限公司生物安全柜 BHC-1300 A2 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司細(xì)菌培養(yǎng)箱 DG-1 上海醫(yī)療器械修理廠霉菌培養(yǎng)箱 MJX-250C 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠集菌儀 HTY-2000B 杭州高德醫(yī)療器械有限公司一次性使用薄膜過(guò)濾器4培養(yǎng)基膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 批號(hào)：20091018膽鹽乳糖培養(yǎng)基 批號(hào)：20090908玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)：20090405營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)：090315營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 批號(hào)：091012改良馬丁液體培養(yǎng)基 批號(hào)：090608改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)：091006曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基批號(hào)：0810015菌種枯草桿菌 (Bacillus subtili

3、s) CMCC(B)63501金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 44102白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98001黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC(F)980036菌液制備6.1取上述經(jīng)35培養(yǎng)1824小時(shí)的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1ml，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5 10-7，約為50100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。6.2取經(jīng)25 培養(yǎng)1824小時(shí)的白色念珠菌改

4、良馬丁液體培養(yǎng)物1ml，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5 10-6，約為50100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。6.3取經(jīng)25 培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁斜面培養(yǎng)物，加5ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，其濁度與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相當(dāng)后，取1 ml稀釋后的孢子懸液，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4，約為50100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。7細(xì)菌計(jì)數(shù)法：7.1供試液制備 取供試品原液作為供試液。 7.2回收率測(cè)定：培養(yǎng)基稀釋法（1）試驗(yàn)組：取供試液1 ml等量分注2個(gè)平皿中，同時(shí)加入50100c

5、fu 試驗(yàn)菌，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置3035培養(yǎng)箱培養(yǎng)2472小時(shí)逐日觀察結(jié)果。（2）菌液組：測(cè)定每一菌株所加的試驗(yàn)菌數(shù)。（3）供試品對(duì)照組：取供試液1 ml等量分注2個(gè)平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂，置3035培養(yǎng)箱培養(yǎng)2472小時(shí)逐日觀察結(jié)果，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。（4）回收率的計(jì)算：按如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收率： 為該株陽(yáng)性菌的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。8 霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)法 ：8.1 供試液的制備：取供試品原液作為供試液。 8.2 回收率的測(cè)定：平皿法（1）試驗(yàn)組：取供試液1 ml和50100cfu 試驗(yàn)菌同時(shí)加入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置2328培養(yǎng)箱培養(yǎng)2472小時(shí)

6、，逐日觀察結(jié)果。（2）菌液組：測(cè)定每一菌株所加的試驗(yàn)菌數(shù)。（3）供試品對(duì)照組：取供試液1 ml加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時(shí)逐日觀察結(jié)果，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。（4）回收率的計(jì)算 按如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收率： 為該株陽(yáng)性菌的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證的試驗(yàn)結(jié)果方法供試液濃度陽(yáng)性菌代數(shù)菌液組（CFU）試驗(yàn)組（CFU）供試品對(duì)照組（CFU）回收率（%）培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）原液大腸埃希菌 2104105100108 0，0100%枯草芽孢桿菌 260594645 0，076%金黃色葡萄球菌 21089791109 0

7、，098%平皿法白色念珠菌 276767472 0，096%黑曲霉 288889191 0，0103%培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）原液大腸埃希菌 295949595 0，0101%枯草芽孢桿菌 261665656 0，088%金黃色葡萄球菌 246414445 0，0102%平皿法白色念珠菌 248513940 0，080%黑曲霉 277777175 0，095%培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）原液大腸埃希菌 288918095 0，098%枯草芽孢桿菌 249504640 0，087%金黃色葡萄球菌 2115116114109 0，097%平皿法白色念珠菌 250494241 0，084%黑

8、曲霉 2868191920，0110%9控制菌檢查方法：大腸埃希菌檢查法：供試液的制備：取供試品原液作為供試液。試驗(yàn)組：取供試液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，同時(shí)加入上述大腸埃希菌液10100cfu，置35培養(yǎng)24小時(shí)，取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。觀察后，沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察。同時(shí)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果。陰性菌對(duì)照組：取供試液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時(shí)加入上述金黃色葡萄球菌10100cfu，置35培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，以下步驟同試驗(yàn)組，結(jié)果見(jiàn)表2 。表2 控制菌檢查法方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果大腸埃希菌檢查試驗(yàn)組（供試液+大腸埃希菌）陰性菌對(duì)照組（供試液+金黃色葡萄球菌）BL培養(yǎng)基 + MUG 靛基質(zhì)試驗(yàn) + + EMB平板 典型菌落生長(zhǎng) 無(wú)菌落生長(zhǎng)加入菌數(shù)（cfu） 54,58 55,6010結(jié)論經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，腦心舒口服液微生物限度檢查法可采用以下方法：10.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)法：培養(yǎng)基稀釋法(取混勻的原液2ml，每ml等量分注2個(gè)平皿) 取供試品原液作為供試液，采用培養(yǎng)基稀釋法，取上述供試液2ml，每1ml供試液等量分注2個(gè)平皿，依法測(cè)定。