高速逆流色譜在天然產物分離提取中的應用

1、高速逆流色譜技術在天然產物高速逆流色譜技術在天然產物分離提取中的應用分離提取中的應用Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design1 12 23 34 4概述高速逆流色譜儀器系統(tǒng)組成及影響因素在天然產物分離提取方面的應用前景展望Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design1.1 定義是利用混合物不同組分在和中分配系數(shù)(或吸附系數(shù)、滲透性等)的差異，使不同組分在作相對運動的兩相中進行反復分配，實現(xiàn)分離的分析方法。色譜法色譜法高速逆流色譜高速逆流色譜連續(xù)高效的液

2、-液分配色譜技術，不用利用任何固態(tài)的支撐物或載體。它利用兩相溶劑體系在高速旋轉的螺旋管內建立起一種特殊的單向性流體動力學平衡，當其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design1.2 發(fā)展史 二十世紀六十年代，首先在日本，隨后在美國國家醫(yī)學研究院發(fā)現(xiàn)了一種有趣的現(xiàn)象：即互不相溶的兩相溶劑在繞成螺旋形的小孔徑管子里分段割據(jù)，并能實現(xiàn)兩溶劑相之間的逆向對流。 ITO及其后來者在此基礎上研究并設計制造出了一系列逆流色譜裝置，早期的是封閉型的螺旋管行星式離心分離儀

3、CPC（coil planet centrifuge），用于分離染料，蛋白質和細胞粒子。數(shù)年后ITO把流通機制引入到螺旋管柱體系中，使逆流色譜和現(xiàn)代色譜一樣可以實現(xiàn)連續(xù)的的洗脫、分離、檢測和收集，并建立了兩個基本的流通體制。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design1.3 HSCCC的技術特點1應用范圍廣，適應性好2操作簡便，容易掌握 3回收率高 4重現(xiàn)性好 5. 分離效率高，分離量較大 與HPLC相比：a.分析成本低b.易于操作c.進樣量大a.溶劑消耗多b.檢測限較低Tankertanker DesignTankerta

4、nker DesignTankertanker Design1.4 HSCCC溶劑體系的選擇 HSCCC成功分離天然產物的關鍵就是選擇合適的溶劑體系。 目前常用分配系數(shù)法來選擇溶劑體系。分配系數(shù)是在體系靜止狀態(tài)下得出的參數(shù),在多數(shù)情況下不能反映出HSCCC高速運轉的工作狀態(tài)。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design高速逆流色譜常用基本溶劑體系表高速逆流色譜常用基本溶劑體系表Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design2.1 高速逆流色譜系統(tǒng)組成制備型高

5、速逆流色譜系統(tǒng)具備較大的柱體總容量，適用于實驗室和產業(yè)化應用的樣品分離和提純。 Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignHSCCC分離流程圖 Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 較大的制備型HSCCC，柱容積可達530m1，一次最多進樣可達20g粗品；較小的分析型的HSCCC柱容積為8m1，進樣量為幾十微克，最大轉速可達4000r

6、/min，分析能力堪與HPLC相媲美。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design2.2 影響因素2.2.1 固定相的保留值 在逆流色譜中，留在管中固定相的量是影響溶質峰分離度的一個重要因素，高保留量將會大大改進峰分離度。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Designa.儀器對保留值的影響（外因） 研究表明：螺旋管支持件的自轉半徑r與公轉半徑R之比B值是一個影響兩相互不混溶溶劑在旋轉螺旋管內保留的關鍵因素。用大直徑的支持件使值進一步提高，能導致親水性溶劑體系

7、的單向性流體動力學分布反向；反之，用小直徑的支持件使值減小，能使疏水性溶劑體系的單向性流體運動方向反向，而介于疏水性和親水性溶劑之間的中間極性溶劑，其兩相分布狀況則會受到離心力條件的影響。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design b.溶劑體系物理因素對保留值的影響（內因） 溶劑體系的物理因素如溶劑的黏度對固定相的保留影響很大，低黏度的溶劑體系可望得到高的固定相保留，界面張力和兩相間的密度差會對溶劑在臨界點附近的分層時間產生較大的影響，一般為保證固定相保留值合適，溶劑體系的分層時小于30s。Tankertanker Des

8、ignTankertanker DesignTankertanker Design 2.2.2 轉速的影響 螺旋管的旋轉速度對兩相溶劑在流體動力學平衡時的體積比，也就是對固定相的保留值的影響很大，從而影響了分離效果。當然，并不是轉速越快越好，一般對于分配得不是太好的溶劑體系，如兩相體系帶有氯仿的，還要固定相分層比較慢的兩相體系，通常情況下轉速越高，越易產生乳化現(xiàn)象。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 2.2.3 流速的影響 流動相流速也會影響兩相的分布，一般情況下，流動相流速越大，固定相流失加重，但流速過慢會導致分

9、離時間過長，從而造成對溶劑的浪費。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 2.2.4 溫度的影響 溫度的提高溶劑的黏度有很大的影響，一般提高溫度會獲得高的保留值，而相反降低溫度則得到低的保留值，但一般溫度不可能提高太多，因為所用的都是有機溶劑，沸點很低。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design3.在分離天然產物中的應用 從天然產物中提取的活性成分是防治疾病和強身健體的物質基礎。從天然產物活性成分中發(fā)展新藥、尋找先導化合物并進行結構修飾是藥物研發(fā)的

10、重要內容,目前,許多市場銷售和進入臨床階段的抗腫瘤和抗感染藥物都來源于天然產物。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design3. 1黃酮、類黃酮及黃酮苷 黃酮類化合物多存在于高等植物和羊齒類植物中，常以游離或與糖結合成苷的形式存在，在花、葉、果實等組織中多為苷類，而在木質部組織中多為游離苷元。主要包括黃酮、異黃酮、二氫黃酮、兒茶精、花色素等及各種衍生物。利用H S C C C 技術能夠很有效的分離提取黃酮類化合物。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Desig

11、n利用HSCCC分離黃酮類化合物Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design3. 2苷類(包括皂苷) 皂苷在中草藥中廣泛存在,由于其分子量大,極性較高，因而分離難度較大。20世紀80年代以前,皂苷類化合物的純化和結構鑒定相對是難度較大的工作。近年來,對皂苷類成分的分離研究取得了較大進展。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design3. 3生物堿

12、 生物堿是重要的天然含氮化合物,對疾病治療和藥物開發(fā)等具有重要意義。近年來,用HSCCC已成功分離了多種生物堿。分離生物堿成分常用的溶劑體系主要有正己烷-乙酸乙酯-甲醇(或者乙醇、正丁醇)-水體系和三氯甲烷-甲醇-水體系、氯仿- 甲醇- 酸性改性劑體系。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design3.4蒽醌類化合物的分離提取 蒽醌類化合物是廣泛存在的重要天然色素，在高等植物和真菌、地衣等低等植物中尤為普遍，中藥中

13、則以蒽醌及其衍生物最為重要，具有瀉下、抗菌、抗癌等生理活性。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design3.5 多酚類化合物的分離提取 多酚類化合物在天然產物中廣泛存在，具有諸多的生物活性。國人最常飲用的茶葉中，所含茶多酚( 主要功效成分兒茶素) 就具有抗氧化、抗溶血、抗口臭、抑制致癌物的形成等眾多生物活性和保健功能。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertank

14、er DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design3.6 香豆素類化合物的分離提取 香豆素及其衍生物是一類重要的香料，大多具有重要的經濟和藥用價值。在植物界中，香豆素及其衍生物分布較為廣泛。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design3.7 其他類化合物的分離提取Tankertanker DesignTankertanker Des

15、ignTankertanker Design4.1 應用方面的研究進展 HSCCC 不僅僅運用在天然產物和中藥有效成分的分離提取，而且在食品、蛋白質和多肽、抗生素的分離純化等方面都有應用。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design4.2 技術方面的研究進展 基于常規(guī)的HSCCC 技術，隨著人們研究運用的深入，人們又發(fā)展了多種HSCCC技術。如雙向逆流色譜(dual countercurrent chromatography，DuCCC)，正交軸逆流色譜(cross-axis coil planet centrifuge，X-axis CPC)，pH-區(qū)帶精制逆流色譜(pH-zone-refining CCC)，H