miRNA及其發(fā)展和應(yīng)用

1、謝東君 2015202030079RNA在生命過程中的作用 mRNA合成蛋白質(zhì)的藍(lán)圖 rRNA合成蛋白質(zhì)的工廠 tRNA合成蛋白質(zhì)的搬運(yùn)工 miRNA？被關(guān)注的RNA研究2000年，RNAi的研究進(jìn)展被Science雜志評為重大科技突破。2001年，RNAi作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”。2002年12月20日，Science雜志將“Small RNA & RNAi”評為2002年度最耀眼的明星。同時，Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成果之一。2003年，microRNA的研究第四次入選“十大科技突破”。2005年，microRNA的研

2、究第五次入選“十大科技突破”。2006年，RNAi獲得當(dāng)年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。并且microRNA的研究第六次入選“十大科技突破”。RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域近20年來，可與HGP相提并論的最重大成果之一。什么是miRNAmiRNA的發(fā)現(xiàn)miRNA的產(chǎn)生過程miRNA的作用機(jī)制miRNA的特點(diǎn) 與其他寡核苷酸相比,主要有三點(diǎn)不同:1. 沒有開放閱讀框架及蛋白質(zhì)編碼基因的特點(diǎn)2. 通常的長度約為22個核苷酸,但在3端可以有幾個堿基的長度變化3. 成熟的miRNA5端有一磷酸基團(tuán),3端為羥基miRNA的生物學(xué)功能miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞的早期發(fā)育參與細(xì)胞分化和組織發(fā)育參與調(diào)節(jié)基因的表

3、達(dá)可用于腫瘤診斷和治療有抗病毒作用調(diào)控干細(xì)胞的自我更新miRNA的保守性Let-7 RNA脊椎動物半索動物軟體動物環(huán)節(jié)動物節(jié)肢動物刺胞動物海綿動物miRNA 靶基因的尋找 盡管數(shù)百種miRNA在最近幾年中被發(fā)現(xiàn)了,但是只有非常少量的miRNA被確定其作用,許多其他的miRNA基因的作用還沒有被闡明。因此發(fā)現(xiàn)miRNA的作用靶點(diǎn)成為了解其在不同的生理過程中的功能的關(guān)鍵。 目前主要利用生物信息學(xué)方法和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法尋找 miRNA 的靶基因。尋找靶基因生物信息學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)方法尋找miRNA 靶基因 生物信息學(xué)方法主要是利用某種算法對靶基因樣本進(jìn)行評分及篩選。 主要遵循以下幾個常用原則:

4、1.miRNA 與其靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性2.miRNA 靶位點(diǎn)在不同物種之間的保守性3.miRNA-mRNA 雙鏈之間的熱穩(wěn)定性4.miRNA 靶位點(diǎn)處不應(yīng)有復(fù) 雜二級結(jié)構(gòu)5.miRNA 5端與靶基因的結(jié)合能力強(qiáng)于 3端 常用的算法有： miRanda、TargetScan、RNAhybrid、PicTar、miTarget等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法尋找miRNA 靶基因 由于計(jì)算機(jī)模擬在預(yù)測 miRNA 靶基因時存在一定的局限性, 因此很多學(xué)者也希望能夠利用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法直觀地尋找 miRNA 靶基因。 一般可以從兩個水平去尋找miRNA靶基因1. 從 mRNA 水平尋找 miRNA 靶基因 2. 從蛋白質(zhì)

5、水平尋找 miRNA 靶基因 從 mRNA 水平尋找 miRNA 靶基因基因芯片法將 miRNA 成熟體雙鏈或腺病毒載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中, 使得 miRNA 在細(xì)胞中過表達(dá), 之后利用基因芯片分析 mRNA的變化以找出相應(yīng) miRNA 的靶基因。由于miRNA在體內(nèi)通過翻譯抑制或影響 mRNA的穩(wěn)定性起作用, 因此這種方法在尋找起翻譯抑制作用的miRNA 的靶基因時存在一定困難. 從 mRNA 水平尋找 miRNA 靶基因免疫共沉淀法利用 AGO 蛋白家族既能結(jié)合 miRNA 又能結(jié)合 mRNA 的特性, 分別使用AGO-1 和 AGO-2 蛋白的單克隆抗體在人類細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀, 得到與 A

6、GO-1 和 AGO-2 蛋白結(jié)合的mRNA 各 600 條, 并通過克隆測序?qū)@些 mRNA 進(jìn)行鑒定. 同時從與 AGO-1 蛋白結(jié)合的 mRNA 中隨機(jī)挑選 6 條進(jìn)行熒光素酶報告基因檢測, 發(fā)現(xiàn)其中有 5條都是 miRNA 的靶基因. 從蛋白質(zhì)水平尋找 miRNA 靶基因細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)分別將成熟 miRNA 雙鏈轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞, 利用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture), 將轉(zhuǎn)染了成熟 miRNA 雙鏈的細(xì)胞和正常細(xì)胞分別培養(yǎng)于含輕/重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記必需氨基酸的培

7、養(yǎng)基中, 經(jīng)過若干次細(xì)胞倍增后, 穩(wěn)定同位素按照序列特異的方式完全摻入到新合成的蛋白質(zhì)中, 通過比較標(biāo)記前后同一肽段的質(zhì)譜峰值變化實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的精確定量. 在檢測了 20005000 個蛋白后, 兩個研究組分別發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)染一條 miRNA 后有幾百個蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了改變, 許多改變在 mRNA 水平上不能得到體現(xiàn). miRNA 靶基因的鑒定 目前最為常用的 miRNA 靶位點(diǎn)鑒定方法是熒光素酶報告基因法. 其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體, 將希望鑒定的 miRNA 靶基因的 3UTR 構(gòu)建到熒光素酶基因的 3UTR 中, 之后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng) miRNA 的表達(dá)

8、水平, 最后檢測熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染 3UTR 中是否含有 miRNA 的靶位點(diǎn)。 miRNA在在腫瘤研究中的應(yīng)用 隨著對miRNA認(rèn)識和了解,越來越多的研究認(rèn)識到它與腫瘤的形成有密切的關(guān)系。如抑制癌基因的miRNA表達(dá)降低,可導(dǎo)致癌基因的過表達(dá);而抑制抑癌基因的miRNA表達(dá)過度,可導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)降低。致癌基因的過表達(dá)與抑癌基因表達(dá)降低均可使腫瘤發(fā)生。 例如miR-155是由人BIC基因編碼的miRNA,在hodgkin淋巴瘤和burkitt淋巴瘤中均高表達(dá)。在burkitt淋巴瘤中, miR-155的前體RNA出現(xiàn)10-30倍的蓄積現(xiàn)象,但是在非hodgkin淋巴瘤中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)。miRNA的研究現(xiàn)狀和展望 目前已發(fā)現(xiàn)了大量的小分子,它們在序列、結(jié)構(gòu)、表達(dá)及功能等方面都不同程度地表現(xiàn)出了多樣性,其中miRNA的表現(xiàn)尤為突出,它很可能在生命活動中起著重