浙大考研-分子生物學重點

1、浙江大學分子生物學考研重點總結載體（vector）: 把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具。電泳：帶電物質在電場中向相反電極移動的現象。核酸限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA的酶，即是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。限制性內切酶作用于磷酸二酯鍵，使雙鏈DNA中兩條單鏈上的3,5-磷酸二酯鍵斷裂，產生的DNA片段5端為P,3端為OH類酶由兩種酶組成及作用: 一種就是通常指的限制性內切酶，它識別并切割某一特異的DNA的核苷酸序列，產生特異的DNA片段；另一種為獨立的

2、甲基化酶,它修飾同一識別序列,使A（嘌呤）甲基化。類酶中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎，絕大多數能識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoR識別六個核苷酸序列:5- GAATTC-3)，有少數酶識別更長的序列或簡并序列。類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3)；有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端（ 3 突出和5 突出的單鏈末端）的DNA片段稱粘性未端可變酶：識別序列中的一個或幾個核苷酸是可變的，且其識別序列一般大于6個堿基。在適當的反應條件下（包括溫度、pH、離子強度等

3、），1小時內完全酶解1ug特定的DNA底物所需要的限制性內切酶的量，定義為1個活性單位（1U) 酶影響限制性內切酶的活性的因素：DNA純度、DNA的分子結構、緩沖液、溫度條件及限制性內切酶本身質粒的基本性質質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,呈超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質粒主要發(fā)現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄的能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。質粒的復制和轉錄主要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質，如離開宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質粒的存在使宿主具有

4、一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。質粒的兩種類型：緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxed control)。前者只在細胞周期的一定階段進行復制,當染色體不復制時，它也不能復制,通常每個細胞內只含有1個或幾個質粒分子，如F因子。后者在整個細胞周期中隨時可以復制,在每個細胞中有許多拷貝，一般在20個以上,質粒的不相容性：利用同一復制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質粒同時導入同一細胞時，它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭，在一些細胞中，一種質粒占優(yōu)勢，而在另一些細胞中另一種質粒卻占上風。當細胞生長幾代后，占少數的質粒將會丟失，因而

5、在細胞后代中只有兩種質粒中的一種，這種現象稱質粒的不相容性。堿法提質粒的原理：用含SDS的堿性溶液即溶液裂解大腸桿菌細胞，變性蛋白質和染色體DNA，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段, 堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀質粒DNA的兩條鏈不會相互分開。然后用溶液中和提取液的pH以使質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中，而線狀染色體DNA片段難以復性，并與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起經離心沉淀，在溶液中只剩下質粒DNA和RNA。溶液中的R

6、NA可用RNA酶A降解，從而使溶液中僅僅留下質粒DNA。DNA片段瓊脂糖凝膠電泳的原理：核酸分子是兩性解離分子，DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負電荷，在 pH 值為 8.0-8.3 時，核酸分子中堿基幾乎不解離，而磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電場中向正極移動。DNA分子在電場中通過瓊脂糖凝膠介質而泳動，除電荷效應外，凝膠介質還有分子篩效應，與DNA分子大小及構像有關，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。對于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對數值成反比。限制性內切酶反應的終止通常有以下三種方法：1、采用65條件下溫浴20min，通過加熱失活內切酶；2、加終止反應液（如0

7、.5 mol/L的EDTA使之在溶液中的終濃度達到10 mmol/L）螯合內切酶的輔助因子Mg2+使內切酶變性以終止反應；3、通過電泳割膠回收或用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀，此法最為有效且有利于下一步的DNA的操作。限制性內切酶用量：對質粒DNA酶切反應而言, 限制性內切酶用量可按標準體系1 g DNA加1單位酶，消化1-2小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-5倍，反應時間也要適當延長，但過分加大酶量，甘油會影響反應外，酶本身會導致識別序列的特異性下降,產生酶的星號活力。限制性內切酶的星號活力及其產生原因：限制性內切酶在非標準的反應條件下，能切割一些與其識別序列類似的序列，這種現

8、象稱星號活力。每一種酶在特別的條件下均會產生這種活力。星號活力的識別形式常對標準識別序列中兩側的堿基沒有特異性。產生星號活力的原因：高甘油含量、酶量過大、低離子強度、高pH（8.0）、含有有機溶劑、非Mg2+的二價離子存在限制性內切酶酶切的限制性內切酶注意事項：1酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應。2進行DNA酶切時，要在其最適溫度下(大多數為37)進行，最好使用每一種酶的專用緩沖液。當要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好，則兩種酶可同時切割。3限制性內切酶一定要低溫下貯存(20)，以防止酶活性降低。4進行大量酶切時，

9、先要確定限制性內切酶的濃度。一般來說，要用2-3倍才能保證完全消化，對基因組DNA尤其如此。5瓊脂糖凝膠的濃度直接影響DNA片段的分離效果，一定要根據被分離DNA片段的大小確定好合適的瓊脂糖凝膠濃度。6EB是DNA的誘變劑具極強的致癌性，配制和使用過程中要特別小心，操作時要戴手套，有EB的廢液和器皿要分別處理好。7大多數限制酶貯存在50甘油溶液中，以避免在-20條件下結冰。當最終反應液中甘油濃度大于5時，某些限制酶的識別特異性降低，從而產生星活性，更高濃度的甘油會抑制酶活性。因此加入反應的酶體積不超過反應總體積的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影響。8反應混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小

10、體積中過高濃度的DNA會形成粘性DNA溶液抑制酶的擴散，并降低酶活性。9酶切反應所加入的酶量應適中，根據底物的種類、量的多少和體積的大小而定，對不同的限制酶，各廠家均有一最大的消化量指標可參考。10反應混合液中加入濃度為0.1 mg/ml的BSA，可維持酶的穩(wěn)定性。11酶切底物DNA應具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醚，大于10 mM的EDTA，去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會不同程度地影響限制酶的活性。 12反應取酶時必須使用新的無菌吸頭，以免污染酶液，同時應盡量縮短酶在溫室的放置時間，從冰箱中取出后，應置于冰上。13.反應前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁

11、上的液滴全部沉至管底。14分子克隆是微量操作技術，DNA樣品與限制性內切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性及全部放入反應體系中。15不同廠家的試劑不可混用，需要時請查明相關條件及數據。16要注意酶切時加樣的次序，一般次序為水、緩沖液、DNA各項試劑，最后才加酶液。取液時，Tip頭要從溶液表面吸取，以防止Tip頭沾去過多的液體與酶溴化乙錠染料檢測核酸的原理：在凝膠中加入少量熒光嵌入染料溴化乙錠（注意：EB是強誘變劑?。浞肿涌刹迦隓NA的堿基之間，形成一種光絡合物，在254-365nm波長紫外光照射下，呈現桔紅色的熒光，因此可對分離的DNA進行檢測，可以檢出1-10ng的DNA條帶，在

12、紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。在電場中決定DNA的遷移速率的因素：在電場中，在堿性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定:1、DNA的分子大小 2、瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構象 4、電源電壓 5、嵌入染料的存在 6、離子強度影響 離心機使用的注意事項 1、離心管一定要平衡好，離心管必須對稱放入套管中，若只有一支樣品管另外一支要用等質量的水代替2、絕對不要超過離心機或轉子的最高限轉速3、一定要在達到預設轉速后，才能離開離心機；若電動離心機如有噪音或機身振動等任何異狀時，應立即切斷電源停機，即時排除故障4、通常聽聲音即可得知離心狀況是否正常，也可注意離心機的震

13、動情形5、啟動離心機時，應蓋上離心機頂蓋后，方可慢慢啟動6、在離心機停止轉動后，方可打開離心機蓋，取出樣品，不可用外力強制其停止運動。乙酸鉀溶液的作用：用高濃度低pH的乙酸鉀溶液中和的作用是使質粒DNA復性，并沉淀大部分去污劑(十二烷基硫酸鉀不溶于水)。酚/氯仿抽提的目的：用酚或酚-氯仿混合液抽提以去除堿裂解液中殘余的蛋白質。 采用酚或酚-氯仿混合液對裂解液用進行抽提是經典的蛋白清除方法。酚相與水相不相溶，當劇烈振蕩然后靜置或離心分相后，變性了的殘余蛋白會沉降出來處于酚相與水相的界面。溶解EDTA二鈉鹽時的關鍵是什么：EDTA二鈉鹽只有當溶液pH用氫氧化鈉調至8.0左右時才能溶解核酸電泳時加樣

14、孔一側靠近陰極（黑末端），配制10 % SDS溶液的主意事項：10 % SDS無須高壓滅菌，SDS有毒，且微細晶粒易于擴散，故稱量時要戴口罩，稱量完后要清除在稱量工作區(qū)和天平上的SDS堿法提質粒的溶液中的葡萄糖的作用：可以提高細菌懸浮液的滲透壓，減少細菌裂解時DNA泄漏過快產生的機械剪切力酚:氯仿:異戊醇（25:24:1體積比混合）的作用：酚、氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可消除抽提過程中出現的泡沫。DNA片段純化回收的原理：本試劑盒適合從各種瓊脂糖凝膠中回收多至8ug DNA (70bp-10kb),回收率為60-85%。瓊脂糖凝膠在溫和緩沖液（DE-A溶液）中溶解，其

15、中的保護劑能防止線狀DNA在高溫下降解，然后在DE-B溶液的作用下使DNA選擇性結合到膜上，經W1、W2溶液的洗滌清除蛋白和鹽分，最后有pH洗脫液從膜上洗脫下來。純化的DNA可直接用于連接、體外轉錄、PCR擴增、測序、微注射等分子生物學實驗。DNA片段純化回收注意事項:1.在步驟1中，將凝膠切成細小的碎塊可大大縮短凝膠融化時間（線性DNA長時間暴露在高溫條件下易水解），從而提高回收率。勿將含DNA的凝膠長時間地暴露在紫外燈下，減少紫外線對DNA造成的損傷。2.步驟2中凝膠必須完全熔化，否則嚴重影響DNA回收率。3.Eluent或去離子水加熱至65，有利于提高洗脫效率。4.DNA分子呈酸性，建議

16、在2.5 mM Tris-HCl，pH8.5洗脫液中保存,減少DNA的脫氨反應。5.盡量切除不含DNA的凝膠。得到凝膠體積越小越好，不然影響回收率。6.回收純化的DNA 片段一般在100bp到50kb之間，過長，過短片段的回收效率迅速降低。7.使用前，Buffer W1中加入等體積的無水乙醇DNA連接的概念：在一定條件下，由DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5端磷酸與3端羥基之間形成磷酸二酯鍵的過程。DNA連接酶主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶，前者是T4噬菌體基因30編碼的產物，后者是大腸桿菌基因組中l(wèi)ig基因編碼的產物。DNA連接酶作用機制：DNA連接酶利用N

17、AD或ATP中的能量催化兩個核酸鏈之間形成磷酸二酯鍵。反應過程可分三步： (1)NAD或ATP將其腺苷?；D移到DNA連接酶的一個賴氨酸殘基的氨基上形成共價的酶-腺苷酸中間物，同時釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)或焦磷酸；(2)將酶-腺苷酸中間物上的腺苷?；俎D移到DNA的5-磷酸基端，形成一個焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸；(3)這個被激活的5'-磷?；丝梢院虳NA的3'-OH 端反應合成磷酸二酯鍵，同時釋放出AMP。 10l反應體系中加入T4 DNA連接酶 1l (350U），溫度 16推薦過夜，通常在4過夜連接效果尚佳。為什么PCR產物可與T載體連接: 因大部分耐熱性DN

18、A聚合酶進行PCR反應時都有在PCR產物的3末端添加一個“A”的特性，能直接和T載體進行TA克隆。藍白斑篩選的機理:載體上帶有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E. coli DH5菌株帶有-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下, 載體和DH5編碼的-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在二者融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間實現互補的現象叫-互補。 由

19、-互補產生的Lac+ 細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到載體的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去-互補能力, 因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。 在麥康凱培養(yǎng)基上，-互補產生的Lac+細菌由于含-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產生乳酸，使pH下降，因而產生紅色菌落，而當外源片段插入后，失去-互補能力，因而不產生-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。 基因帶有相同的粘性末端的連接的

20、策略： 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端。在連接反應中外源片段和質粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。1）必須仔細調整連接反應中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產物的數量達到最高水平。2）可將載體DNA的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去除, 最大限度地抑制質粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產生一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子，在轉入E. coli受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。 堿性磷酸酶（CIAP)在連接中的

21、作用：是一個二聚體蛋白，它是從線狀DNA上去除5磷酸基團，從而抑制質粒DNA的自身連接和環(huán)化?；蜻B接的注意事項：1.DNA連接酶用量與DNA片段的性質有關，連接平末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。2. 連接反應后，反應液在0儲存數天，-80儲存2個月，但是在-20冰凍保存將會降低轉化效率。 3. 粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應溫度為37，在連接粘性末端時，反應溫度以10-16為好，平齊末端則以15-20為好。 4. 在連接反應中，如不對載體分子進行去5磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自

22、身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機會。轉化：將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。在基因克隆技術中，轉化特指將質粒DNA或以其為載體構建的重組DNA導入細菌體內，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。DNA分子轉化的原理：吸附完整的雙鏈DNA 分子吸附在受體菌表面；轉入雙鏈DNA 分子解鏈，單鏈DNA 分子進入受體菌，另一鏈降解；自穩(wěn)外源質粒DNA 分子在細胞內又復制成雙鏈環(huán)狀DNA；表達供體基因隨同復制子同時復制，并被轉錄和翻譯。熱擊轉化包括的主要步驟：從-70冰箱中取200 l感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍，解

23、凍后立即置冰上；加入連接產物，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘；42水浴中熱擊60秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻5分鐘；向管中加入1 ml LB液體培養(yǎng)基，混勻后37振蕩培養(yǎng)1小時；將上述菌液在6500 rpm離心3分鐘，剩余100 l 上清，將沉淀混勻后涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)16-24小時。感受態(tài)細胞：受體細胞經過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2，RbCl(KCl)等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenent cells)制備感受態(tài)細胞的關鍵：受體細胞一般應

24、是限制-修飾系統缺陷的突變株，并應具有最佳的細胞生長狀態(tài)和密度；器具必須是非常潔凈的，試劑均需是最高純度的；制備過程中保證菌體的有氧代謝；控制細胞懸浮液中的各種離子；制備感受態(tài)細胞過程中防治菌株被污染；保存感受態(tài)時，使用冷凍保護劑，并采用液氮速凍感受態(tài)細胞；要在冰上操作。轉化子：帶有異源DNA分子的受體細胞。CaCl2法制備感受態(tài)細胞的原理：是細菌處于0，CaCl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42短時間熱沖擊處理，促使細胞吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增值，被轉化的細菌中，重組子中基

25、因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉化子（即帶有異源DNA分子的受體細胞 ）。 質粒轉化的方法有哪幾種：熱擊轉化法：使用化學試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細胞，通過42熱擊處理將載體DNA分子導入受體細胞。電擊轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。提高轉化率因素，即轉化的注意事項： 1. 細菌生長狀態(tài)和密度2. 質粒的質量和濃度3. 試劑的質量4. 防治雜菌和雜DNA的污染5. 整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。 衛(wèi)星菌落：有些載體帶有-內酰胺酶的基因，表達出-內酰胺酶，它可以破壞氨卞青霉素。當細

26、菌培養(yǎng)時間過長，-內酰胺酶積累過多，就會使氨卞青霉素失效，導致不含質粒的空菌落大量生長，這就是衛(wèi)星菌落。PCR(Polymerase Chain Reaction, 聚合酶鏈反應)是DNA基因在體外的一種擴增方法。PCR的基本原理及三個步驟：PCR(Polymerase Chain Reaction, 聚合酶鏈反應)是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與體內相似，不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱(變性)、冷卻(退火、保溫(延伸)等改變溫度的辦法使DNA得以復制，反復進行變性、退火、延伸循環(huán)，就可使DNA無限擴增。PCR具體分三個基本步驟：(

27、1)變性(Denature):將PCR反應體系升溫至94左右，目的雙鏈的DNA模板就解開成兩條單鏈，此過程為變性；(2) 退火(Anneal):將溫度降至引物的Km值以下(50左右)，3'端與5'端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補區(qū)域通過氫鍵配對結合，此過程稱為退火；(3)延伸(Extension)：當將反應體系的溫度升至70左右時，耐熱的Taq DNA聚合酶催化四種脫氧核糖核苷酸按照于與模板DNA的核苷酸序列的互補方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA鏈。由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),每一次循環(huán)使反應體系中的DNA分子數增加約一倍,這些經合成產生的DNA又可作

28、為下一輪循環(huán)的模板,所以經25-35輪循環(huán)就可使DNA擴增達106倍。參與PCR反應體系的因素及其作用參與PCR反應的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、緩沖液、Mg2+、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、反應溫度與循環(huán)次數、PCR儀：1. 引物：PCR反應產物的特異性與長度由一對上下游引物，即5'端引物與3'端引物所決定。5'端引物是指與模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指與模板3'端序列互補的寡核苷酸。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚

29、體, 過低則降低產量。引物設計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：(1) 引物長度約為16-30bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費, 難以合成,且引物過長使延伸溫度超過Taq DNA聚合酶的最適溫度(74度)，亦會影響產物的特異性。(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度：Tm4(G+C)+2(A+T)。(3) 四種堿基應隨機分布，尤其在3'端不應存在連續(xù)3個G或C,否則會使引物與核酸的G或C富集區(qū)錯誤互補，而影響PCR的特異性。(4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核

30、苷酸對應, 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。(5) 在引物內, 尤其在3'端應不存在二級結構。引物自身不應存在互補序列而引起自身折疊，起碼引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。(6) 兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現引物二聚體, 減少產量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 (7) 引物5'端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等。通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。(8) 引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩(wěn)定的二

31、級結構, 以免產生非特異性擴增,影響產量。引物與非特異靶區(qū)之間的同源性不要超過70或有連續(xù)8個互補堿基同源，否則導致非特異性擴增。(9) 簡并引物應選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應不存在簡并性。否則可能由于產量低而看不見擴增產物。(10) 引物3'端是引發(fā)延伸的點。因此不應錯配。由于ATCG引起錯配有一定規(guī)律，以引物3'端A影響最大，因此，盡量避免在引物3'端第一位堿基是A。引物3'端也不要是編碼密碼子的第三個堿基，以免因為密碼子第3位簡并性而影響擴增特異性。5GTAGATGGACTTATGC3CGTCCCGGTGAC

32、TCCTGGAATAATCGTCCATCCACTCTAAATCAGTTACGGCCTTATCCGCAGGAGTTGAAGTACAAAGGATGTATGATTCGAGGCTTACGGAGTAGAGATGTTCATTTTTCCAGCTTTCAATGGTCTCATGACACATGAGGGACTCGATGGGAAACTCAGGTGTGTAAGTGCTAACTGGGTCTGGGAATAGATGGCGTGCAGTGTAGTCGAAGTC33CGTCACATCAGCTTCAG 5 反向引物，亦稱下游引物 2. 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP為PCR反應的合成原料。dNTP原液可配成5-10 mm

33、ol/L并分裝，-20貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200mol/L，在此范圍內，PCR產物的量、反應的特異性與忠實性之間的平衡最佳。當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。 3. Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大, Mg2+濃度過低，Taq酶活力顯暑降低；Mg2+濃度過高，又使酶催化非特異性擴增。通常Mg2+濃度范圍為0.5-2 mmol/L。 4. 模板：PCR反應必須以DNA為模板進行擴增，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分

34、子，也可以是環(huán)狀分子。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數量和純度。模板量過多則可能增加非特異性產物。DNA中的雜質也會影響PCR的效率。 5. Taq DNA聚合酶：純化的Taq酶在體外無3'-5'外切酶活性，因而無校正閱讀功能，在擴增過程可引起錯配。錯配堿基的數量受溫度、Mg2+濃度和循環(huán)次數的影響。在100 l PCR反應中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán)。所用的酶量可根據DNA、引物及其它因素的變化進行適當的增減，酶量過多會使產物非特異性增加，過少則使產量降低。6. 反應緩沖液：緩沖液提供PCR反應合適的酸堿度與某些離子，反應緩沖液

35、一般含10-50 mmol/L Tris·Cl, 緩沖液中含有50 mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+，Tris·Cl在20時pH為8.3-8.8，但在實際PCR反應中，pH為6.8-7.8、50mmol/L的KCl有利于引物的退火。 PCR反應有哪些參數1. 變性：在第一輪循環(huán)前，在94下預變性2-5 min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性，減少DNA產量。一般變

36、性溫度與時間為94 1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。對于富含GC的序列，可適當提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。為防止在變性溫度時反應液的蒸發(fā)，可在反應管內加入1-2滴液體石蠟或PCR儀器設置成熱蓋。 2. 退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5。一般當引物中GC含量高,長度較長并與模板完全配對時, 應提高退火溫度。退火溫度越高, 所得產物的特異性越高。而退火溫度過低，易引起非特異性擴增。

37、 Tm：引物的解鏈溫度，相當于4(G+C)+2(A+T)。可按下式粗略估計引物的解鏈溫度：Tm4(G+C)+2(A+T)。實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低53. 延伸：延伸反應通常為72，接近于Taq DNA聚合酶的最適反應溫度75。延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應體系中，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb長的DNA。延伸時間過長會導致產物非特異性增加，但對很低濃度的目的序列, 則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應，以獲得盡可能完整的產物, 這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。 4. 循環(huán)次數：

38、當其它參數確定之后, 循環(huán)次數主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經足夠。循環(huán)次數過多，會使PCR產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30輪循環(huán)擴增后, 反應中Taq DNA聚合酶已經不足, 如果此時產物量仍不夠, 需要進一步擴增, 可將擴增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應底物進行擴增, 這樣經60輪循環(huán)后, 擴增水平可達109-1010 。在PCR擴增后期，由于產物積累，使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線，產物不再隨循環(huán)數而明顯上升，這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次

39、數，在平臺期前結束反應,減少非特異性產物。 標準PCR反應體系試劑的加入次序：水、10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物、引物、模板DNA、 Mg2+ 、Taq DNA聚合酶一般在擴增反應完成后,都需要72延伸10min的作用：以獲得盡可能完整的產物, 這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。 為什么PCR循環(huán)次數不是越多越好？1.平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。 2.通常經25-30輪循環(huán)擴增后, 反應中Taq DNA聚合酶已經不足。說出PCR產物和質粒載體的連接反應策略？在許多

40、研究中，需要將PCR產物克隆,以獲得目的DNA片段。通常將PCR產物插入到載體中有下列一些方法： 1.平末端連接由于Taq DNA聚合酶往往在PCR產物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產物前，可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶處理補平末端。 2.PCR產物與T-載體直接連接：Taq DNA聚合酶會在3端加上多余的非模板依賴堿基,而且對A優(yōu)先聚合，所以PCR產物末端的多余堿基大部分都是A目前一些公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產物的帶3'-T的T-Vector。 3.粘性末端連接利用引物中附加在5'端的限制酶位點,直接將PCR產物經適當的限制

41、酶切割后產生粘性末端，與載體連接,產生重組DNA。如果上下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點，經酶切后定向克隆到載體中。 PCR常見問題及原因：PCR常見問題1無擴增產物：陽性對照有條帶，而樣品則無原因：1、模板含有抑制物，含量低2、引物設計不當或者發(fā)生降解3、退火溫度太高，延伸時間太短PCR常見問題2PCR中出現非特異性擴增的可能原因？非特異性擴增： PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致；或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。原因：1、引物特異性差2、模板或引物濃度過高3、酶量過多4、 Mg2+濃度偏高5、退火溫度偏低6、循環(huán)次數過多PCR常見問題3假陽性： 空白對照出現目的條帶。

42、原因：1、靶序列或擴增產物的交叉污染對策：1、操作時防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；2、 除不能耐高溫的物質外，所有試劑器材均高壓消毒。離心管及槍頭等一次性使用。3、 各種試劑先進行分裝，低溫貯存。 菌落PCR ：是直接以轉化菌的單個克隆為模板, 通過特異性引物或通用引物對插入載體中的目的基因快速擴增，用于鑒定和篩選陽性轉化菌的技術。PCR反應的注意事項：1.PCR非常靈敏, 操作應盡可能在無菌操作臺中進行。 2.吸頭、離心管應高壓滅菌, 每次吸頭用畢應更換, 不要互相污染試劑。3.加試劑前, 應短促離心10秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面。 4.應

43、設含除模板DNA外所有其它成分的陰性對照和陽性對照。 CTAB提植物基因組DNA的原理：離子型表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)等可以有效裂解植物細胞壁，且與DNA形成可溶于高鹽溶液的復合物，當降低鹽濃度時DNA又可沉淀析出，從而與蛋白質及多糖等分離。CTAB、SDS等離子型表面活性劑能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚 / 氯仿等有機溶劑，使蛋白質變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入異丙醇 / 無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE或

44、水溶液中，即得植物總DNA溶液。 CTAB提植物基因組DNA的注意事項：1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質多，必須用 10 mM 的 -ME 處理。葉片磨得越細越好。2研缽預凍，粉末至加 CTAB 前不要融化。324:1 的氯仿/異戊醇抽提時動作應輕柔，轉移用的槍頭最好是剪寬的。4所用試劑必需滅菌，戴手套。5. EDTA 只有在pH 達8.0 時才能徹底溶解，當EDTA溶解至少量時，緩慢滴加10 M NaOH調pH至8.0。如萬一pH調過8.0，則補加EDTA·2H2O重新定容。用Trizol試劑提取植物總RNA的原理：Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍

45、可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質。水相中的RNA用異丙醇沉淀，75%酒精洗滌，DEPC水溶解即可。RNA提取中使用焦碳酸二乙酯 ( DEPC )的作用及主意事項DEPC是RNA酶的化學修飾劑，它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性；DEPC為劇毒物，盡量在通風柜中操作DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物，因而使用時需小心；試驗所用試劑

46、可用DEPC處理，加入DEPC至0.1%濃度處理12小時以上，然后高壓滅菌以消除殘存的DEPC （DEPC會分解成水和CO2 ），否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞RNA活性；DEPC能與胺和巰基反應，因而含Tris的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌；DEPC對單鏈的 DNA或RNA具有破壞作用；配制的溶液如不能高壓滅菌,，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。RNA電泳為什么要用甲醛瓊脂糖凝膠變性電泳？因RNA具有二級結構，需變性成鏈狀，這樣不同分子量的RNA才能通過電泳（根據分子量大?。┒珠_。提RNA失敗的原因？RT-PCR原理將RNA

47、的反轉錄（Reverse Transcription，RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術，近年來得到快速發(fā)展和廣泛應用。首先，經反轉錄酶的作用，以RNA為模板，合成互補的DNA鏈（cDNA），再以cDNA為模板，通過PCR擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列、分析基因的轉錄產物、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統等。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。反轉錄酶（Revers

48、e Transcriptase，RTase）自然界中廣泛存在著一類以RNA為遺傳物質的反轉錄病毒，其攜帶的反轉錄酶是一類以RNA為模板，合成cDNA的DNA聚合酶。目前在生命科研領域中應用較為廣泛的有鳥類成髓細胞性白血病病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）反轉錄酶（AMV RT）、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine L：Leukemin Virus，M-MLV) 反轉錄酶（M-MLV RT）及其改造重組體M-MLV（RNase H）。AMV酶由兩條肽鏈組成,有依賴于RNA及DNA的DNA合成的聚合酶活性和對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解的很強的Rnase H活性; 最適溫度為42, 最適pH為8.3。M-MLV酶由一條肽鏈組成, 有依賴于RNA及DNA的DNA合成的聚合酶活性和較低的Rnase H活性; 在42下很快失活; 最適pH為7.6。AMV RT具有反轉錄活性高、最適反應溫度較高（4150）的特點，可以較好地克服由于模板二級結構造成的反轉錄困難問題，然而由于AMV RT的RNase H活性高，易降解cDNA-RNA復合物中的RNA鏈，導致合成的cDNA片段偏短，一般為1 kb左右。M-MLV RT的RNase H活性較低，