教學(xué)課件-無(wú)菌接種和培養(yǎng)技術(shù)

1、無(wú)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)無(wú)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)一、一、微生物無(wú)菌操作技術(shù)微生物無(wú)菌操作技術(shù)無(wú)菌操作無(wú)菌操作目的：目的： 保證待檢物品不被環(huán)境中微生物污染；保證待檢物品不被環(huán)境中微生物污染； 防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。無(wú)菌操作技術(shù)：無(wú)菌操作技術(shù)：指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類(lèi)微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。類(lèi)微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。1 1接種針接種針 2.2.接種環(huán)接種環(huán) 3.3.接種鉤接種鉤 4.5.4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.6.接種圈接種圈 7.7.接種

2、鋤接種鋤 8.8.小解剖刀小解剖刀一、一、微生物無(wú)菌操作技術(shù)微生物無(wú)菌操作技術(shù)無(wú)菌操作材料無(wú)菌操作材料：一、一、微生物無(wú)菌操作技術(shù)微生物無(wú)菌操作技術(shù)無(wú)菌操作材料無(wú)菌操作材料： 材料材料 器械和用品：酒精燈、記號(hào)筆、標(biāo)簽、火柴、滅器械和用品：酒精燈、記號(hào)筆、標(biāo)簽、火柴、滅菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌水、試管架菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌水、試管架 菌種菌種 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：二、原理：二、原理：v 無(wú)菌技術(shù)：無(wú)菌技術(shù)：指在微生物實(shí)驗(yàn)工作指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類(lèi)微生物的污中，控制或防止各類(lèi)微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。有關(guān)措施。v 接種：接種：將微生物接到適于它生長(zhǎng)將微

3、生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程。體內(nèi)的過(guò)程。微生物無(wú)菌操作技術(shù)與接種技術(shù)微生物無(wú)菌操作技術(shù)與接種技術(shù)v 接種的準(zhǔn)備工作接種的準(zhǔn)備工作 無(wú)菌環(huán)境的要求與保持無(wú)菌環(huán)境的要求與保持 進(jìn)入無(wú)菌室前的準(zhǔn)備進(jìn)入無(wú)菌室前的準(zhǔn)備 無(wú)菌操作的要求無(wú)菌操作的要求v 接種的操作方法接種的操作方法二、二、 微生物接種技術(shù)微生物接種技術(shù)無(wú)菌環(huán)境無(wú)菌環(huán)境無(wú)菌室無(wú)菌室超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)無(wú)菌環(huán)境的要求與保持無(wú)菌環(huán)境的要求與保持（一）接種的準(zhǔn)備工作（一）接種的準(zhǔn)備工作（1）無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：）無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：v 應(yīng)有更衣間、緩沖間、操應(yīng)有更衣間、緩沖間、操作間作間v 應(yīng)有良好的

4、通風(fēng)條件，安應(yīng)有良好的通風(fēng)條件，安裝空調(diào)設(shè)備及過(guò)濾設(shè)備裝空調(diào)設(shè)備及過(guò)濾設(shè)備1 1、無(wú)菌室、無(wú)菌室無(wú)菌環(huán)境的要求與保持無(wú)菌環(huán)境的要求與保持無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)（2）無(wú)菌室的消毒和防污染）無(wú)菌室的消毒和防污染v 無(wú)菌室內(nèi)空氣測(cè)試應(yīng)基本達(dá)到無(wú)菌。無(wú)菌室內(nèi)空氣測(cè)試應(yīng)基本達(dá)到無(wú)菌。v 每日（使用前）紫外線照射（每日（使用前）紫外線照射（12小時(shí)）小時(shí)）.v 每周用甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（每周用甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）小時(shí)）.v 每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。v 定期作實(shí)驗(yàn)室沉降菌計(jì)數(shù)，以檢查無(wú)菌室微生物生長(zhǎng)繁殖定期作實(shí)驗(yàn)室

5、沉降菌計(jì)數(shù)，以檢查無(wú)菌室微生物生長(zhǎng)繁殖動(dòng)態(tài)。動(dòng)態(tài)。無(wú)菌環(huán)境的要求與保持無(wú)菌環(huán)境的要求與保持 超凈工作臺(tái)是為實(shí)驗(yàn)室工作提供無(wú)菌操作環(huán)境的設(shè)施，超凈工作臺(tái)是為實(shí)驗(yàn)室工作提供無(wú)菌操作環(huán)境的設(shè)施，以保護(hù)實(shí)驗(yàn)免受外部環(huán)境的影響，同時(shí)為外部環(huán)境提供某以保護(hù)實(shí)驗(yàn)免受外部環(huán)境的影響，同時(shí)為外部環(huán)境提供某些程度的保護(hù)以防污染并保護(hù)操作者。些程度的保護(hù)以防污染并保護(hù)操作者。 原理：超凈工作臺(tái)的潔凈環(huán)境是在特定的空間內(nèi)，潔凈原理：超凈工作臺(tái)的潔凈環(huán)境是在特定的空間內(nèi)，潔凈空氣空氣( (進(jìn)濾空氣進(jìn)濾空氣) )按設(shè)定的方向流動(dòng)而形成的。以氣流方向按設(shè)定的方向流動(dòng)而形成的。以氣流方向來(lái)分，現(xiàn)有的超凈工作臺(tái)可分為垂直式，由

6、內(nèi)向外式以及來(lái)分，現(xiàn)有的超凈工作臺(tái)可分為垂直式，由內(nèi)向外式以及側(cè)向式。側(cè)向式。 2 2、超凈工作臺(tái)、超凈工作臺(tái)無(wú)菌環(huán)境的要求與保持無(wú)菌環(huán)境的要求與保持垂直流超凈工作臺(tái) 水平流超凈工作臺(tái)水平流超凈工作臺(tái) 垂直流超凈工作臺(tái)垂直流超凈工作臺(tái) v風(fēng)速保持在風(fēng)速保持在0.32-0.480.32-0.48米米/ /秒秒v使用前打開(kāi)紫外燈照射使用前打開(kāi)紫外燈照射4060minv開(kāi)啟超凈工作臺(tái)工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用開(kāi)啟超凈工作臺(tái)工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用75%的酒精或的酒精或0.5%過(guò)氧過(guò)氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺(tái)面。乙酸噴灑擦拭消毒工作臺(tái)面。v使用中，有機(jī)玻璃罩受到污染，嚴(yán)禁用酒精棉球擦拭，請(qǐng)用含水棉布檫

7、拭；使用中，有機(jī)玻璃罩受到污染，嚴(yán)禁用酒精棉球擦拭，請(qǐng)用含水棉布檫拭；v請(qǐng)保持超凈臺(tái)整潔、干燥，不要堆積雜物；請(qǐng)保持超凈臺(tái)整潔、干燥，不要堆積雜物；v使用完畢，關(guān)閉煤氣開(kāi)關(guān)或酒精燈；使用完畢，關(guān)閉煤氣開(kāi)關(guān)或酒精燈；v使用完畢后，使用完畢后，用消毒液擦拭工作臺(tái)面，關(guān)閉工作電源，重新開(kāi)啟紫外燈用消毒液擦拭工作臺(tái)面，關(guān)閉工作電源，重新開(kāi)啟紫外燈照射照射15min. .v定期做無(wú)菌試驗(yàn)，以測(cè)定凈化臺(tái)是否符合無(wú)菌要求。定期做無(wú)菌試驗(yàn)，以測(cè)定凈化臺(tái)是否符合無(wú)菌要求。無(wú)菌環(huán)境的要求與保持無(wú)菌環(huán)境的要求與保持超凈臺(tái)的使用與維護(hù)超凈臺(tái)的使用與維護(hù)3 3、無(wú)菌器材準(zhǔn)備、無(wú)菌器材準(zhǔn)備v 滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、

8、無(wú)菌衣等滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無(wú)菌衣等. v 消毒器材：接種試管、無(wú)菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、消毒器材：接種試管、無(wú)菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺(tái)等工作臺(tái)等無(wú)菌環(huán)境的要求與保持無(wú)菌環(huán)境的要求與保持（1）定期檢查無(wú)菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；）定期檢查無(wú)菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；（2）用紫外線滅菌處理）用紫外線滅菌處理3060min；（3）檢查無(wú)菌器材是否完備；）檢查無(wú)菌器材是否完備；（4）實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入無(wú)菌室前先用肥皂洗手，然后用）實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入無(wú)菌室前先用肥皂洗手，然后用75酒酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟＞耷驅(qū)⑹植粮蓛簟＃?）緩沖室內(nèi)換上洗凈并經(jīng)紫外線燈照射過(guò)的工作衣、帽、）緩沖室內(nèi)換上洗凈

9、并經(jīng)紫外線燈照射過(guò)的工作衣、帽、鞋。鞋。無(wú)菌操作要求無(wú)菌操作要求（1 1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作；）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作；（2 2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。（3 3）在火焰上方操作；）在火焰上方操作；（4 4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5 5）在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)）在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)。（6 6）不能用嘴直接吸吹吸管。）不能用嘴直接吸吹吸管。（7 7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5%5%來(lái)蘇爾溶液的來(lái)蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。消毒

10、桶內(nèi)消毒。 無(wú)菌操作要求無(wú)菌操作要求無(wú)菌操作要求無(wú)菌操作要求無(wú)菌操作要求無(wú)菌操作要求 接種的基本程序接種的基本程序 常用接種方法常用接種方法 斜面接種斜面接種 劃線接種劃線接種 液體接種液體接種 穿刺接種穿刺接種 （二）接種的操作方法（二）接種的操作方法1 1、接種的基本程序、接種的基本程序滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)沾取標(biāo)本沾取標(biāo)本接種接種滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境操作需在無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)操作需在無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行進(jìn)行無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)使用前后需無(wú)菌室、

11、超凈工作臺(tái)使用前后需進(jìn)行消毒。進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌滅菌（二）接種的操作方法（二）接種的操作方法斜面接種斜面接種劃線接種劃線接種液體接種液體接種穿刺接種穿刺接種 （二）接種的操作方法（二）接種的操作方法2 2、常用的接種方法、常用的接種方法 斜面接種：斜面接種： 從已生長(zhǎng)好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮從已生長(zhǎng)好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮斜面培養(yǎng)基上的接種方法。斜面培養(yǎng)基上的接種方法。 用于用于好氣性微生物好氣性微生物的接種。的接種。（二）接種的操作方法（二）接種的操作方法1)標(biāo)記：接種前在試管上注明菌名、接種日期、接種人標(biāo)記

12、：接種前在試管上注明菌名、接種日期、接種人姓名姓名2)點(diǎn)燃酒精燈。點(diǎn)燃酒精燈。3)接種：接種：（1）手持試管）手持試管 將菌種管和待接斜面管用大姆指和其他四將菌種管和待接斜面管用大姆指和其他四指握在左手中，中指位于兩管之間。斜面向上，指握在左手中，中指位于兩管之間。斜面向上，盡量盡量放平放平。（2）旋松管塞）旋松管塞（3）接種環(huán)灼燒滅菌）接種環(huán)灼燒滅菌 斜面接種斜面接種 斜面接種斜面接種3）接種：接種：（4）拔管塞：拔管塞： 用右手的無(wú)名用右手的無(wú)名指、小指和手掌邊先后取指、小指和手掌邊先后取下菌種管和待接試管的管下菌種管和待接試管的管塞，讓試管口緩緩過(guò)火滅塞，讓試管口緩緩過(guò)火滅菌菌(切勿燒得

13、過(guò)燙切勿燒得過(guò)燙) 斜面接種斜面接種3）接種：接種：（5）取菌）取菌: 接種環(huán)冷卻，輕接種環(huán)冷卻，輕沾取少量菌體或胞子，沾取少量菌體或胞子，然后將接種環(huán)移出菌種然后將接種環(huán)移出菌種管，注意不要使接種環(huán)管，注意不要使接種環(huán)碰到管壁，取出后帶菌碰到管壁，取出后帶菌接種環(huán)不可通過(guò)火焰。接種環(huán)不可通過(guò)火焰。 斜面接種斜面接種3）接種：接種： （6）接種）接種: 在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入待接斜面管。在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入待接斜面管。從斜面培養(yǎng)基底部向上作從斜面培養(yǎng)基底部向上作“Z”形來(lái)回密集劃線，勿形來(lái)回密集劃線，勿劃破培養(yǎng)基。劃破培養(yǎng)基。 有時(shí)也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央拉一

14、條直有時(shí)也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央拉一條直線作斜面接種，直線接種可觀察不同菌種的生長(zhǎng)特線作斜面接種，直線接種可觀察不同菌種的生長(zhǎng)特點(diǎn)。點(diǎn)。 斜面接種斜面接種3）接種：接種： (7) 塞管塞：塞管塞： 取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動(dòng)時(shí)管塞旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動(dòng)時(shí)納入不潔空氣。納入不潔空氣。 (8) 將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。 斜面接種示意圖斜面接種示意圖 由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的由斜面菌接種到液體培

15、養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。方法。操作方法：操作方法： 與斜面法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基與斜面法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時(shí)使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散時(shí)使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上棉塞再輕輕搖勻。，塞上棉塞再輕輕搖勻。 如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一般用移液管或如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一般用移液管或滴管接種滴管接種 液體接種液體接種2 2、常用的接種方法、常用的接種方法劃線劃線接種接種目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長(zhǎng)，形成單個(gè)菌落，以便目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長(zhǎng)，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌、活菌計(jì)數(shù)。

16、獲得純菌、活菌計(jì)數(shù)。方法：方法： 分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本 連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本2 2、常用的接種方法、常用的接種方法劃線劃線接種接種2 2、常用的接種方法、常用的接種方法分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)劃線劃線接種接種2 2、常用的接種方法、常用的接種方法連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法劃線劃線接種接種2 2、常用的接種方法、常用的接種方法 用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到用接種針從菌種斜面上挑

17、取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體或半 固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法。固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法。 用于用于厭氣性厭氣性細(xì)菌培養(yǎng)、檢查細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)、檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力、運(yùn)動(dòng)能力、保藏菌保藏菌種種。 只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng)只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng)穿刺穿刺接種接種2 2、常用的接種方法、常用的接種方法穿刺接種方法：穿刺接種方法： 1) 標(biāo)記標(biāo)記 2) 點(diǎn)燃酒精燈點(diǎn)燃酒精燈 3）接種）接種 （1）手持試管）手持試管 （2）旋松棉塞）旋松棉塞 （3）接種針灼燒滅菌，把在穿刺中可能伸入試管的其他）接種針灼燒滅菌，把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也灼燒滅菌部位也灼燒滅菌 2 2、常用的接種方

18、法、常用的接種方法穿刺穿刺接種接種3）接種）接種（4 4）拔出棉塞）拔出棉塞（5）取菌：用冷卻接種針的針尖沾取少量菌種）取菌：用冷卻接種針的針尖沾取少量菌種（6）穿刺：將接種針自培養(yǎng)基中心平穩(wěn)、快速垂直刺入）穿刺：將接種針自培養(yǎng)基中心平穩(wěn)、快速垂直刺入培養(yǎng)基，至接近試管底部，然后沿接種線拔出培養(yǎng)基，至接近試管底部，然后沿接種線拔出（7）塞上棉塞）塞上棉塞（8）接種針灼燒滅菌）接種針灼燒滅菌2 2、常用的接種方法、常用的接種方法穿刺穿刺接種接種1 1、什么是無(wú)菌技術(shù)？、什么是無(wú)菌技術(shù)？2 2、如何做好無(wú)菌室的消毒和防污染工作？、如何做好無(wú)菌室的消毒和防污染工作？3 3、如何做好超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)？、如何做好超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)？4 4、無(wú)菌操作的目的是什么？、無(wú)菌操作的目的是什么？5 5、進(jìn)入無(wú)菌室前要做好哪些準(zhǔn)備工作？、進(jìn)入無(wú)菌室前要做好哪些準(zhǔn)備工作？6 6、驗(yàn)操作過(guò)程的無(wú)菌操作要求包括哪些內(nèi)容？、驗(yàn)操作過(guò)程的無(wú)菌操作要求包括哪些內(nèi)容？7 7、 接種時(shí)，為何要盡量使試管平放？接種時(shí)，為何要盡量使試管平放？8