HCV 結構的介紹

1、Questions 1對HCV的初步理解1、其基因結構：HCV是正鏈RNA 病毒，傳播的途徑為血液傳播?；蛉L為9.6kb包括5'-NCR、一個長的開放閱讀框（0RF），編碼組成約3000個氨基酸的多蛋白前體，和3'-NCR.2、目前hcv研究的現(xiàn)狀：患者多，治療方法不徹底，再感染幾率大，潛伏期長，大部分患者會造成慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病。研究其感染機制，病毒與宿主細胞的相互作用，一方面能夠為制出特異性藥物提供思路，另一方面是研發(fā)有效疫苗的必經(jīng)之路。目前病毒性肝炎的治療多以聚二乙醇干擾素和利巴韋林，蛋白酶抑制劑聯(lián)合用藥，但是機體對干擾素應答的副作用大，再感染幾率高。在研究

2、方面HCV感染后血清中病毒含量極低，同時目前缺乏有效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)及合適的動物模型繁殖病毒，無法獲得大量的天然病毒抗原，目前只能通過合成肽或基因重組的方法，獲得HCV包膜蛋白抗原。同時還缺乏有效的疫苗。3、感染后缺乏有效的免疫的可能原因（1）HCV高度變異，逃避機體的免疫清除；（2）HCV在肝組織及血液中含量低及誘導機體產生保護性的抗原性弱；（3）病毒顆粒與低密度脂蛋白或免疫球蛋白緊密聯(lián)接，導致抗原決定簇被掩蓋；（4）外周血淋巴細胞可能有HCV儲存庫的作用。4、研究點：對于以上問題決定我們研究HCV的方向為編碼蛋白和宿主因子在HCV復制、組裝過程中相互作用，治病機制、疫苗的開發(fā)等。Questi

3、ons 2該病毒蛋白的結構和功能（功能機構，與宿主細胞相互作用，引發(fā)疾?。?、 HCV的RNA及其翻譯加工HCV含有9.6 kb的正鏈RNA基因組5'-NCR，一個長的開放閱讀框，編碼組成約3000個氨基酸的多蛋白前體，和3'-NCR.5'-NCR高度保守，有1-4個域，域一不是IERS起始必須的，但是域一和二是RNA復制所必須的。每一個HCV都有一個IERS序列，是翻譯起始必須的序列。3'-NCR由一個80個核苷酸序列組成的多聚U的可變區(qū)和一個由98個核苷酸組成的X-尾巴的不變區(qū)組成。3'-NCR是一個順勢作用原件，編碼NS5B蛋白。在細胞培養(yǎng)和體內時

4、3'-NCR.和5'-NCR都是必須的。5'-NCR的域二，三，四和核心基因的20-40個核苷酸構成IRES序列。RNA的翻譯起始：IERS序列和40S核糖體結合形成一個48S的二元復合物，然后在真核生物起始因子eLF3的幫助下與RNA上的AUG序列結合，形成eIF2Met-tRNAiGTP三元復合物，最后的限速步驟是依賴于GTP的與60S核糖體結合成80S的復合物。HCV的ORF翻譯產生了蛋白前體是共翻譯后通過細胞和病毒蛋白酶處理為成熟的結構與非結構蛋白。結構蛋白和p7多肽是由內質網(wǎng)處理（ER）信號肽酶處理而非結構蛋白由兩種病毒NS2-3蛋白酶和NS3-4A絲氨酸蛋白

5、酶處理。2、 核心蛋白coreHCV的ORF翻譯的第一個蛋白，其由功能區(qū)轉入內質網(wǎng)腔的信號在內質網(wǎng)膜上C與E1之間。信號序列被信號肽酶裂解。最終成為分子量為21道爾頓的核心蛋白.其N端是高比例的堿性氨基酸，稱為D1，可以使兩個同源RNA聚合在一起。核心蛋白發(fā)現(xiàn)與內質網(wǎng)膜上的脂滴中，為高度螺旋蛋白。脂滴是一個相對疏水的環(huán)境，這不僅確保蛋白質的折疊還有利于病毒蛋白的復制，形態(tài)發(fā)生。核心蛋白與脂滴可能相互作用影響脂質代謝，促進肝臟的脂肪變性，這是經(jīng)常出現(xiàn)在C型肝炎，特別是患者感染基因型3。3、 包膜糖蛋白E1和E2。包膜蛋白E1和E2是糖基化形成的非共價復合物，給病毒形成一個保護囊。丙型肝炎病毒糖蛋

6、白的成熟和折疊是一個復雜的過程，涉及ER機械伴侶和取決于二硫鍵形成以及糖基化?？缒そY構域E1和E2，位于其C末端的異源二聚體并具有ER滯留性能。都由兩個可延伸的疏水性氨基酸通過短極性鍵連接。第二疏水片段為E2下游和p7中內部信號肽蛋白質。內信號序列斷裂前，E1和E2的跨膜結構以發(fā)夾結構與易位子相連。信號肽裂解之后，信號序列被重新定位，偏向胞質溶膠，最終形成單一的跨膜通道。E1和E2的三維結構的測定將是為闡明由這些蛋白質介導受體結合和融合過程的關鍵。4、 P7。P7是一個63個氨基酸的多肽與E2常不完全切割。它的兩個跨膜通過一個的胞質環(huán)連接，并且N端和C端被定向向ER內腔。在體外， HCVRNA

7、復制中p7不需要，但在體內生產性感染中必不可少。據(jù)報道，根據(jù)其低聚物和陽離子通道活性，這表明它屬于的體內蛋白質家族，并在病毒顆粒的成熟和釋放中有重要的作用。因此可用于對抗病毒藥物干預。5、 NS2-3蛋白酶。NS2-3蛋白酶也被稱為該autoprotease，是丙型肝炎病毒難以研究的蛋白質之一。對于HCV在體RNA復制是可有可無的，但無論在體外還是體內其對復制的周期所必需的。NS2-3蛋白酶催化活性在NS2的C-末端半和NS3N端三分之一處。定點誘變表明，氨基酸His143，Glu163和Cys184是蛋白水解活性所必須的。NS2是與細胞膜有關的蛋白。其N-末端域包含至少一個（可能是三個）跨膜

8、段，缺乏該域重組蛋白名保留該酶的活性。NS2的蛋白酶晶體結構域的結構（氨基酸殘基94-217，NS2pro）得以解剖。NS2pro形成的二聚體具有兩個復合活性中心。每個活性中心都是由兩種殘基單體組成，一種單體是殘基His143和Glu163，另一種單體是Cys184殘基。這種結構改變了HCV的蛋白加工的看法，如以前認為NS2-3裂解發(fā)生在順單分子反應（因此指定autoprotease）。但是，對于二聚化以形成活性NS 2-3蛋白酶要求表明NS2-3裂解和絡合物形成可以由NS2的濃度來調節(jié)。了解N末端膜結構可能會NS2額外的功能如最近發(fā)現(xiàn)的生產感染病毒必需影響病毒生命周期的一步。有趣的是，高效的

9、HCV嵌合體的融合位點在NS2構建。6、 NS3-4A復合物。 NS3是一種多功能蛋白，位于N-末端的三分之一處是一種絲氨酸蛋白酶位于C末端三分之二的蛋白質具有RNA解旋酶/ NTPase活性。這兩種酶的活性已經(jīng)充分表征，以及高分辨率結構具有已經(jīng)得到。該NS4A多肽的NS3絲氨酸蛋白酶用作輔因子。其中心部分被合并為一個整體組分摻入酶核心，和其N-末端部分與膜形成NS3-4A 復合物。該NS3-4A絲氨酸蛋白酶已經(jīng)成為制定特定抑制劑作為抗病毒藥物的對象。其催化中心為His57，Asp81形Ser139。底物特異性的決定因素包括：酸性氨基酸殘基在P6處的位置，到P1半胱氨酸（包括反式切割位點）或蘇

10、氨酸（ciscleavageNS3和NS4A）和氨基酸之間用小側鏈連接的殘余物，即，丙氨酸或絲氨酸，在P1'位置（一致切割序列D / EXXXXC / TS / AXXX）。NS34A絲氨酸蛋白酶有一個不同尋常的淺底物結合的口袋里，因此需要長期的與表面底物互動。最近已經(jīng)表明在先天性免疫中，NS3-4A絲氨酸蛋白酶切割兩個無活性的重要接頭蛋白，即Trif77（也稱為TICAM-1）和Cardif（也稱為MAVS79，IPS-1和VISA）。Cardif蛋白是線粒體外膜上蛋白，以前觀察到一個NS3-4A的小部分定位于線粒體上。這些發(fā)現(xiàn)對于HCV發(fā)病原理的研究將產生極大的影響。NS3解旋酶是

11、2DExH/ D盒解旋酶家族的成員。它結合雙鏈RNA使其解螺旋，或結合單鏈RNA具有廣泛的二級結構的區(qū)域，利用對ATP水解螺旋。7、 NS4-B。NS4B是相對分子質量為27-kDa的蛋白質。其功能之一是誘導形成膜狀結構，所述特異性膜改變在HCV復制復合物中作為支架。它被預測含有4個跨膜片段和最近一直報道兩個C端半胱氨酸被棕櫚?；瘹埢乙孕纬傻途畚铩５?，詳細膜拓撲和低聚中的作NS4B功能仍有待澄清。8、 NS5-A。NS5-A是磷酸化蛋白質，發(fā)現(xiàn)有底部磷酸化56KDa的和過磷酸化58KDa的蛋白質。最近的生化和功能研究表明，-同種型蛋白激酶CKI的可負責NS5A 的過磷酸化。NS5A的磷酸化

12、是丙型肝炎病毒屬和瘟病毒中的保守特征，并且還發(fā)現(xiàn)，在黃病毒NS5蛋白，認為它在HCV生命周期中發(fā)揮重要作用。細胞培養(yǎng)適應性突變往往會影響位于中心的絲氨酸所需要的超磷酸殘基，這表明這NS5A磷酸化狀態(tài)調制HCV RNA復制的效率。根據(jù)一種模式，NS5A的過度磷酸化減少與人小泡相關膜蛋白相關蛋白A（HVAP-A）的相互作用。此囊泡分揀蛋白包括在脂滴中非結構蛋白和參與病毒RNA復制的相關蛋白。NS5A是通過N端的兩親性螺旋嵌入膜雙層的胞質小葉錨定于膜一個蛋白。這個螺旋具有被嵌入在胞質膜界面的疏水性，富色氨酸面，而極性，帶電面暴露于胞質溶膠和可能是參與特定蛋白質 - 蛋白質相互作用，這對功能性的HCV

13、的形成復制至關重要對重組NS5A進行序列分析和同時比較三個蛋白質水解域（翻譯可能錯誤）該晶體的保守結構域一的結構膜 - 錨定螺旋透出二聚結構和限定的表面特性可能涉及與病毒RNA和細胞膜蛋白的相互作用事實上， 假設背向從該膜產生'爪狀“二聚體槽，可以容納任單鏈或雙鏈RNA。深，高堿性凹槽部分可以用有利于接觸RNA，'延伸出來的部分酸性強，有助于防止RNA的退出槽。NS5A的RNA結合性質已被生物化學證實。根據(jù)一種假說，多個NS5A二聚體可以形成對細胞內的膜的二維陣列，從而產生一個“基本鐵路'將允許RNA的滑動。 NS5A的其他區(qū)域將保護其免受細胞RNA酶降解，或從識別由雙

14、鏈RNA誘導的抗病毒防御機制。根據(jù)這個模型，NS5A將系繩病毒RNA到細胞內膜和協(xié)調其不同。根據(jù)一種假說，多個NS5A二聚體可以在細胞膜形成二維陣列，從而產生一個“基本通道'允許RNA的滑動。 NS5A的其他區(qū)域將保護其免受細胞RNA酶降解，或識別由雙鏈RNA誘導的抗病毒防御機制。根據(jù)這個模型，NS5A將病毒RNA束縛在細胞內膜并協(xié)調不同丙型肝炎病毒復制過程中的命運。在受感染的細胞中，許多核心蛋白分子需要以基因組RNA復制產生摻入大量過量非結構蛋白。這些非結構蛋白在膜上的形成的格或列可能有其他的功能。在HCV復制中只有一小部分的非結構蛋白參與RNA的復制。如上所述，過量的非結構蛋白的積

15、累也可能是用于啟動RNA復制之前拮抗宿主細胞的重要先天抗病毒途徑。9、 NS5B。HCV是正鏈RNA病毒。無論是利用病毒RNA作為模板，利用宿主細胞的復制系統(tǒng)復制出負鏈RNA或者隨后形成的正鏈RNA的復制都依賴NS5B RDNP酶。該酶被廣泛的描述，NS5B也成為研制抗病毒藥物的對象。HCV NS5B蛋白中含有所有RdRps基序，包括標志GDD內基序、C序列，并基于所述相似性酶結構的右手的形狀的，經(jīng)典的手指，手掌和拇指子域。丙型肝炎病毒的RdRp的一個特點是，廣泛手指和拇指子域之間的相互作用導致一個完全封閉活性位點。此功能和其他RdRps酶相同。類似的脊髓灰質炎病毒的RdRp，已報道HCV N

16、S5B的低聚為RNA合成的活性重要條件。丙肝病毒RdRp是所謂的“尾錨定蛋白”。膜聯(lián)系是由C末端21個氨基酸殘基，在體外這是可有可無的聚合酶，但在細胞內是RNA復制不可缺少的。膜定位發(fā)生由翻譯后機制并造成NS5B的完整的膜關聯(lián)。10、ARFP /F蛋白另一種閱讀框（ARF）在HCV核心編碼區(qū)被確定的是，作為在基因型1a -2 / + 1核糖體移碼的結果，有的電位，以高達160個氨基酸的蛋白質進行編碼，指定ARFP（替代閱讀框蛋白）或F（移）蛋白質（見參考文獻109）。氨基酸測序表明，移碼可能發(fā)生在，或接近，核心蛋白序列的11密碼子。然而，多個，并且部分分離物依賴性的，移碼的事件，以及內部翻譯起

17、始，也有報道。檢測抗體的和T細胞所特有的ARFP / F中的蛋白質丙型肝炎患者表明，這些蛋白質是丙型肝炎病毒感染期間表達。然而，ARFP /F蛋白不需要用于體外HCV RNA復制或體內最近的證據(jù)表明，一個或多個保守和功能的重要元素RNA存在于核心基因/ ARF。然而，這些功能，如果有的話，ARFP的/在生命周期F蛋白質和丙型肝炎病毒的發(fā)病機制仍有待澄清Questions 3病毒復制復合物病毒復制復合物包括病毒蛋白，復制RNA和改變細胞膜組成的相關復合物，到目前為止的文獻綜述以上是所有正性的標志鏈RNA病毒復制復合物。根據(jù)病毒，復制可能發(fā)生在從派生改變膜ER，高爾基體，線粒體或溶酶體連。膜在病毒

18、RNA合成的作用還不是很清楚。它可能包括：實物支持和組織的RNA復制復合物;條塊分割和病毒產品的局部濃度;退繞時的病毒RNA的束縛;提供脂質成分的復制很重要的;和從雙鏈RNA介導宿主防御或RNA干擾保護病毒RNA的膜質網(wǎng)是一種特別的膜改變，在Huh-7細胞含有HCV復制亞基因組是RNA復制的部位膜狀纖維網(wǎng)的形成是誘導由NS4B單獨和非常相似的“海綿狀夾雜物“用電子顯微鏡觀察以前在HCV感染的黑猩猩的肝。它是目前推測膜質幅源自ER膜。正在進行的研究旨在表征的宿主因素與涉及細胞過程形成HCV復制復合物。最近的研究顯示HCV RNA復制和細胞脂質代謝，推測通過交換和病毒及宿主蛋白質與細胞內膜的關聯(lián)之

19、間的復雜的相互作用。在細胞培養(yǎng)物中，HCV RNA復制是由飽和的和單不飽和脂肪酸的刺激，以及由多不飽和脂肪酸或抑制脂肪酸合成抑制。這些結果表明，膜的流動性是在復制復合物的功能是重要的。此外，我們發(fā)現(xiàn)的一種或多種宿主蛋白質的那前期所需的HCV RNA復制。一種這樣的蛋白質是FBL-2，其包含一個F-box基序，并可能參與靶蛋白降解，雖然自然底物是目前未知。這樣的觀察表明，藥理操縱脂質代謝可能具有治療潛力的丙型肝炎感染。最近的研究已經(jīng)確定參與HCV RNA復制的其他宿主因素。利用敏感的環(huán)孢素A（CSA）在體外觀察抑制HCV RNA復制，親環(huán)素B的確定為環(huán)孢素A的靶細胞。結果表明，親環(huán)b與NS5B相

20、互作用，從而刺激其RNA結合活性。親環(huán)B是肽基 - 脯氨酰cistrans異構酶。這種酶的活性具有AS-yetundefined丙型肝炎病毒RNA復制的作用?；谶@些發(fā)現(xiàn)，非免疫抑制性環(huán)孢素A類似物目前正在更多最近開發(fā)作為對丙型肝炎的抗病毒藥物，它表明，F(xiàn)KBP8（的FK506結合蛋白家族的一個成員）和Hsp90的形成具有NS5A一個復雜的，并有一個重要的角色HCV RNA復制。然而，F(xiàn)K506（他克莫司）不結合FKBP8和不抑制丙型肝炎病毒RNA復制包裝，組裝，粒子釋放關于病毒生命周期的步驟是鮮為人知的，近期才開始進行研究。NS2和可能的其它非結構蛋白，如以及尚未將要定義的RNA的結構，涉及

21、在生命周期過程中。病毒顆粒大概是由出芽形成進入內質網(wǎng)，或ER衍生的隔室，并退出該細胞通過分泌途徑。一個可能的鏈接脂蛋白代謝和病毒裝配和之間釋放已提議。、影響藥物開發(fā)原則上，所述HCV生命周期（圖1）的各步驟是用于抗病毒干預的靶。生物化學和結構上良好表征NS3-4A絲氨酸蛋白酶和NS5B RdRp進行的特異性抑制劑目前正在開發(fā)作為抗病毒劑，以及第一方案已經(jīng)在臨床試驗中進行了評估。絲氨酸蛋白酶抑制劑似乎特別有前途，因為它們不僅阻斷病毒蛋白加工，但也可能是由丙型肝炎病毒反向先天免疫傳感的抑制。此外，新的目標已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)上面強調了最近的研究，包括除其他外，HCV 5'-NCR，病毒進入和融合，在

22、P7的離子通道，NS2-3蛋白酶和NS5A。此外，影響宿主因素藥物參與HCV復制正在探索作為抗病毒劑。在這個早期階段就已經(jīng)是明顯的是，HCV遺傳變異性，這有利于抗病毒抗性的快速發(fā)展，是一個重大的挑戰(zhàn)，以特定抑制劑的臨床發(fā)展及的是，在共同與HIV感染的聯(lián)合治療將是必要的治療成功。.Questions 4侵入宿主細胞時，與宿主細胞的聯(lián)系（切斷聯(lián)系可研制抗病毒藥物）1、 GAG。葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)GAGs是由氨基己糖和糖醛酸兩種己糖衍生物組成的直鏈高分子化合物，廣泛存在于細胞表面，并可作為多種病毒的結合位點，包括黃病毒屬的登革病毒 j。GAGs有硫酸軟骨素

23、、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸類肝素、肝磷脂和透明質烷幾種類型，但只有高度硫酸化的GAGs，如硫化肝素(HS)參與多種病毒的結合和內化，同樣也觀測到HCV和GAGs的結合 引。通過對sE2、HCVpp、HCVcc以及患者血清中分離出的HCV的研究表明，GAGs中肝磷脂(HS類似物)和肝素酶(可降解細胞表面的HS)抑制了HCV與靶細胞的結合，糖苷酶處理HCV敏感細胞后，對HCV易感性降低 。病毒附著到Hs可能在HCV感染的早期起到重要作用，但是其在HCV的入胞機制中作用尚不明確。sE2在細胞內對肝磷脂有高度的親和力，但是通過對HCVpp的研究(表面有E1E2異二聚體)并沒有類似效應 ，提示HS的

24、結合位點在功能性E1E2異二聚體不容易獲得或真實的HCV吸附到細胞表面的GAGs是病毒顆粒與脂蛋白結合。而最近的研究表明，脂蛋白脂酶介導的病毒黏附作用在一定程度上促進了HCV人胞2、DCSIGN、LSIGN和ASGPRDCSIGN、LSIGN和ASGPR均為3型鈣依賴性植物凝集素，胞外區(qū)C-末端包含一個糖結合位點，可通過鈣離子依賴方式與病毒糖基結合。DCSIGN表達于枯否細胞、樹突狀細胞和淋巴細胞，LSIGN表達于肝竇內皮細胞。DCSIGN和LSIGN通過高甘露糖寡糖對sE有高度親和力，同樣也可和HCVpp以及患者血清中分離出的HCV病毒顆粒結合 。由于DCSIGN和LSIGN均不在肝細胞上表

25、達，而兩者表達的細胞均與肝細胞相鄰，推測在HCV的感染過程中兩者作為捕獲和轉移人肝細胞的受體 。ASGPR則直接存在于肝細胞的表面，能同昆蟲細胞中產生的El、E2蛋白結合，HCV類似顆粒(HCVLPs)能通過ASGPR內化入肝細胞 。但關于ASGPR的資料不多，有待于進一步研究。3、CD81CD81是分子量為26 kD的非糖基化膜蛋白，屬于四跨膜(tetraspanin)蛋白超家族，廣泛分布于多種組織和細胞表面，以非共價結合方式與多種分子形成復合物，參與細胞的黏附、激活、信號轉導，增殖和分化等多種功能 。CD81有四個跨膜區(qū)、一大一小兩個細胞外環(huán)(small extracellular loo

26、p，SEL和large extracellular loop，LEL)和2個胞質內的N一末端及C一末端。1998年Pileri等首先發(fā)現(xiàn)sE2可以與細胞表面蛋白CD81 LEL相結合，從而推斷CD81可能是HCV入胞的受體 而這種結合具有種屬特異性，sE2不與鼠細胞表面的CD81結合 。此后多個實驗證實CD81參與HCV感染，抗CD81單克隆抗體以及可溶型CD81一LEL均可抑制HCVcc和HCVpp在體外及體內感染 。 。不表達CD81的肝癌細胞株HepG2和HH29，通過轉染易位表達CD81后，獲得對HCVcc和HCVpp的易感性 舭 。而通過siRNA下調CD81的表達或CD81的特異性

27、抗體則可抑制患者血清中分離出的HCV的感染 。一些研究提示CD81是在HCV與細胞的黏附之后發(fā)揮作用的 1 J。HCV僅感染表達CD81的肝細胞，但是在非肝細胞株的易位CD81表達并不能表現(xiàn)易感性，這提示HCV入胞尚需要其他分子 。另外，EWI-2wintCD81的分子伴侶可抑制HCV人胞，而這種天然抑制物在肝細胞表面的表達缺失可能是導致HCV嗜肝性的另一因素。4、SRB ISRB I是一個由509個氨基酸組成的細胞表面糖蛋白，屬于清道夫受體家族，由2個短的胞質區(qū)、2個跨膜區(qū)和1個大的細胞外環(huán)結構組成。SRB I可在大部分哺乳動物細胞中表達，但在肝細胞和類固醇生成組織中的表達水平明顯高于其他細

28、胞。與CD81類似，SRB I可與sE2相互作用，推測SRB I是HCV入胞的假定受體 J，而通過HCVpp和HCVcc的研究表明，SRB I參與HCV入胞 馴。用抗SRB I多克隆抗體預培養(yǎng)Huh-'細胞能夠降低HCVpp的感染。而采用siRNA的方法使SR B I的表達下調至5時，HCVpp的人胞減少90 。SRB I的主要天然配體是高密度脂蛋白(HDL)，SRB I的主要生物學功能是介導HDL的膽固醇脂的選擇性吸收，研究發(fā)現(xiàn)HDL并非是HCV人胞的競爭者，而是能促進HCVpp和HCVee的入胞 川。但這一作用與SRB I的表達有極大的關系，因為當通過RNA干擾引起靶細胞不表達SR

29、B I時，這一效應大大降低。HDL可以易化HCV人胞是通過激活sR-B I或HDL與脂質細胞膜相互作用。血清淀粉樣蛋白A(semi amyloidA，SAA)是肝臟發(fā)生感染、損傷、炎癥后生成的一種急性相蛋白 ，SRB I可以結合并內化SAA，研究表明SAA可抑制HCV的入胞 ，而HDL可以降低SAA的抗病毒作用，HDL和SAA之間可能為競爭關系。具體機制需要進一步研究。SRB在HCV人胞中的作用尚不明確，可能是通過病毒顆粒直接與SRB I作用C29,34，但是也有研究提示HCV通過SRBI相關的脂蛋白作用 ?？筍R-B I抗體的動力學抑制研究表明HCV入胞需要CD81和SRB I同時表達 。最

30、近研究IFN的抗病毒作用與降低細胞表面SRB I的表達有關 ，這些研究表明SRB I在HCV入胞中的作用。5、緊密連接整合蛋白CLDN1和Occludin緊密連接是細胞連接的主要成分，對維持表皮和內皮細胞的選擇滲透性屏障功能是非常關鍵的。緊密連接有兩個重要的功能，一是封閉細胞間的空隙使表皮與內皮細胞的頂端和基底液體腔室分割開來，另一是作用是維持細胞極性。緊密連接復合物由occludins、Claudins、JAMs(junctionassociated molecules)和CARs(the coxsackie vires B adenovirus receptors)四種跨膜蛋白組成 。緊密

31、連接的CLDN1和Occludin是新近發(fā)現(xiàn)的與HCV入胞相關的蛋白質。1CLDN1：CLDN1是Claudin家族之一，是一種在肝細胞高表達的胞間緊密連接組分 。該分子由211個氨基酸組成，形成2個細胞外環(huán)、3個細胞內結構域和4個跨膜結構，外環(huán)分子1(first extracellular loop，EL1)上含有1段高度保守序列，是該家族分子的特征性結構，與HCV人胞有關的區(qū)域可能位于該序列上 J。CLDN1是目前惟一一個通過異位表達于非肝源細胞而使該細胞對HCV易感的分子：在293T和SW13細胞表面表達CLDN1后，HCVpp對該細胞的易感性增加。而Huh-7細胞CLDN1的沉默表達降

32、低對HCV易感性 。動力學研究表明CLDN1參與晚期HCV人胞的過程，在HCV和CD81結合或SRB I結合后發(fā)揮作用。Claudin家族成員CLDN6、CLDN9同樣介導HCV入胞 J，CLDN6、CLDN9具有高度保守的EL1，并和CLDN1明顯的序列同源性。不同于CLDN1，CLDN6、CLDN9同時還在HCV可能的肝外復制場所外周血單核細胞中表達。CLDN6、CLDN9在CD81陽性的內皮細胞表達可使不同基因型的HCVpp入胞。這提示Claudin蛋白在HCV的生活周期中的重要作用。2Occludin：OCLN與CLDN1同為緊密連接整合蛋白，定位于細胞側膜的近頂面處，相對分子質量6O

33、 kD，由4個跨膜區(qū)，2個細胞外區(qū)和胞質內N一末端、c一末端組成 。OCLN是緊密連接中最重要的結構蛋白，不僅能通過外環(huán)以拉鏈式結合產生嚴密的細胞旁封閉，還與不同分子結合，參與緊密連接形成的信號調節(jié)。目前認為CLDN1是HCV感染人肝源細胞系所必需的，但同時在人非肝源細胞系HeLa和HepH細胞(天然表達CD81和SRB I)中過表達CLDN1，并不能是細胞對HCV易感，提示HCV的入胞還需要其他受體參與 。Liu等 通過siRNA和shRNA干擾降低CLDN1和OCLN在細胞表面的表達可抑制HCVcc和HCVpp入胞，共聚焦顯微觀察發(fā)現(xiàn)OCLN和E2蛋白結合后在內質網(wǎng)處聚集 ，免疫沉淀法和pulldown assay進一步證實E2和Occludin和結合 。Ploss等 將HCV兩種易感細胞Huh75和Hep3B細胞OCLN分子表達沉默后觀察到2種細胞被HCVpp和HCVcc感染能力均有丟失，隨后又將OCLN分子