植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

1、編輯課件1提高植物細胞培養(yǎng)中次生代謝提高植物細胞培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法產(chǎn)物產(chǎn)量的方法編輯課件2初生代謝初生代謝(primary metabolism)是指能使營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換成細是指能使營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換成細胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)、維持細胞正常的生命活動或能量的代謝，初胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)、維持細胞正常的生命活動或能量的代謝，初生代謝的產(chǎn)物稱為初生代謝產(chǎn)物生代謝的產(chǎn)物稱為初生代謝產(chǎn)物(primary metabolites)，如糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等。它們是維持細胞生命活動如糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等。它們是維持細胞生命活動所必需的。所必需的。次生代謝產(chǎn)物次生代謝產(chǎn)物(secondary metabolites)是指植

2、物體內(nèi)的一大是指植物體內(nèi)的一大類細胞生命活動或植物生長發(fā)育正常運行非必需的小分子類細胞生命活動或植物生長發(fā)育正常運行非必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常具有種屬、器官、組織和有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常具有種屬、器官、組織和生長發(fā)育期的特異性，次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過生長發(fā)育期的特異性，次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝程稱為次生代謝(secondary metabolism) 。 前言前言編輯課件3編輯課件41.1.外植體選擇外植體選擇2.2.高產(chǎn)細胞系選擇高產(chǎn)細胞系選擇3.3.物理因素：光照、物理因素：光照、pHpH、通氣、接種量、通氣、接種量4.4.化學因素：培養(yǎng)基

3、種類及激素化學因素：培養(yǎng)基種類及激素 誘導劑誘導劑 前提物質(zhì)添加前提物質(zhì)添加 抑制劑添加抑制劑添加 提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法編輯課件51. 1. 外植體選擇外植體選擇l首先必須選擇能夠高效合成目的產(chǎn)物的植物種類。首先必須選擇能夠高效合成目的產(chǎn)物的植物種類。l起始培養(yǎng)材料還應考慮器官和組織特異性，通常選取自起始培養(yǎng)材料還應考慮器官和組織特異性，通常選取自然狀態(tài)下能夠積累次生產(chǎn)物部位的細胞，這樣的細胞經(jīng)然狀態(tài)下能夠積累次生產(chǎn)物部位的細胞，這樣的細胞經(jīng)過培養(yǎng)以后常常具有合成目的產(chǎn)物的能力，或比較容易過培養(yǎng)以后常常具有合成

4、目的產(chǎn)物的能力，或比較容易誘導合成目的產(chǎn)物。誘導合成目的產(chǎn)物。東北紅豆杉幼嫩莖、葉片以及芽三種外植體的愈傷組東北紅豆杉幼嫩莖、葉片以及芽三種外植體的愈傷組織中紫杉醇含量比較顯示，以織中紫杉醇含量比較顯示，以葉片葉片為外植體的愈傷組為外植體的愈傷組織，其紫杉醇含量是其它兩種外植體形成的愈傷組織織，其紫杉醇含量是其它兩種外植體形成的愈傷組織的的3 3倍。倍。在茜草（在茜草（Rubia cordifoliaRubia cordifolia）愈傷組織培養(yǎng)中，來源愈傷組織培養(yǎng)中，來源于于葉柄和莖葉柄和莖的愈傷組織蒽醌的積累量比來源于莖尖和的愈傷組織蒽醌的積累量比來源于莖尖和葉的愈傷組織高。葉的愈傷組織高

5、。 編輯課件6 解決植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物含量低的最有效的手段之一是解決植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物含量低的最有效的手段之一是篩選高產(chǎn)細胞株。用來篩選的細胞來源可以是有足夠生理和形態(tài)篩選高產(chǎn)細胞株。用來篩選的細胞來源可以是有足夠生理和形態(tài)異質(zhì)性的細胞群，也可以是通過物理或化學因子誘變處理產(chǎn)生的異質(zhì)性的細胞群，也可以是通過物理或化學因子誘變處理產(chǎn)生的突變體群。突變體群。 篩選方法篩選方法: :目測法目測法, ,放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、流動細胞測定法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、流動細胞測定法、瓊脂小塊法等。瓊脂小塊法等。2. 2. 高產(chǎn)細胞株的篩選高產(chǎn)細胞株的篩選 編輯課件7光照：光照：對次生代謝

6、產(chǎn)物的合成有重要影響對次生代謝產(chǎn)物的合成有重要影響. . 不同植物細胞不同植物細胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時, , 對光質(zhì)和光量的要求是不同的對光質(zhì)和光量的要求是不同的, , 如玫瑰茄懸浮細胞合成花青素時如玫瑰茄懸浮細胞合成花青素時, , 藍光是促進玫瑰茄細藍光是促進玫瑰茄細胞產(chǎn)生花青素的最有效單色光胞產(chǎn)生花青素的最有效單色光, , 產(chǎn)量為產(chǎn)量為416 mg/ L, 416 mg/ L, 和全和全色光差不多色光差不多, , 紅光和橙光無效紅光和橙光無效, , 其他單色光隨其波長接其他單色光隨其波長接近藍光近藍光, , 正效應增強。正效應增強。pHpH值：值：植物細胞培養(yǎng)的最適宜植物細

7、胞培養(yǎng)的最適宜pH pH 值在值在5-6 5-6 之間之間, ,但也存在但也存在差異。研究表明差異。研究表明, ,南方紅豆杉南方紅豆杉( ( Tax us chinensis ) ) 的愈傷的愈傷組織生長及紫杉醇的含量受組織生長及紫杉醇的含量受pH pH 值的影響較大值的影響較大,pH 5.5 ,pH 5.5 對對愈傷組織生最為有利愈傷組織生最為有利, ,達接種量的達接種量的3.84 3.84 倍倍, ,但紫杉醇的含但紫杉醇的含量較量較 低低,pH 7.0 ,pH 7.0 時時, ,愈傷組織的生長量僅為接種量愈傷組織的生長量僅為接種量2.802.80倍倍, ,而紫杉醇含量卻達而紫杉醇含量卻達p

8、H 5.5 pH 5.5 時的時的2 2 倍多。倍多。3. 物理因素物理因素 編輯課件8溫度：溫度：不同種類的植物細胞培養(yǎng)對溫度的要求是不同的不同種類的植物細胞培養(yǎng)對溫度的要求是不同的, , 最最適的溫度為適的溫度為25 25 左右左右, , 超過超過30 , 30 , 對生長有明顯的抑制對生長有明顯的抑制作用作用. . 較低的溫度有利于生物堿的合成較低的溫度有利于生物堿的合成, , 而高溫則會導致而高溫則會導致次生代謝產(chǎn)物的合成基本停止。次生代謝產(chǎn)物的合成基本停止。通氣狀況：通氣狀況：國外學者研究發(fā)現(xiàn)國外學者研究發(fā)現(xiàn): : 利用生物反應器培養(yǎng)長春花利用生物反應器培養(yǎng)長春花細胞生產(chǎn)阿瑪堿時細胞

9、生產(chǎn)阿瑪堿時, , 溶解氧在溶解氧在29%-43% 29%-43% 時時, ,溶解氧與阿瑪堿溶解氧與阿瑪堿的產(chǎn)量顯著相關(guān)。的產(chǎn)量顯著相關(guān)。接種量：接種量：接種量影響次生代謝產(chǎn)物的有效積累接種量影響次生代謝產(chǎn)物的有效積累, , 接種時必須接種時必須滿足一定的接種量。滿足一定的接種量。編輯課件94. 化學因素化學因素4.1 培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分l 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：一方面要滿足植物細胞的生物量培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：一方面要滿足植物細胞的生物量 增長，另一方面要使細胞能合成和積累次生產(chǎn)物。增長，另一方面要使細胞能合成和積累次生產(chǎn)物。l 一般來說，增加培養(yǎng)基的一般來說，增加培養(yǎng)基的N N、P P和和K K

10、的濃度能促進細胞生的濃度能促進細胞生長，而適當增加糖濃度則有利于次生產(chǎn)物的合成。長，而適當增加糖濃度則有利于次生產(chǎn)物的合成。l 生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度對細胞的生長、分化和次生生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度對細胞的生長、分化和次生 產(chǎn)物的合成起著重要的作用。產(chǎn)物的合成起著重要的作用。紅豆杉細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加一定濃度的紅豆杉細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加一定濃度的2,4-D2,4-D，可以顯著提高細胞生長速率，增加細胞生物量，添加可以顯著提高細胞生長速率，增加細胞生物量，添加適當濃度的適當濃度的BABA和和KTKT，則可提高紫杉醇的積累。，則可提高紫杉醇的積累。編輯課件104.2 添加誘導子添加誘導子l誘

11、導子誘導子，是指能夠誘導植物細胞中一個反應，并形成細胞，是指能夠誘導植物細胞中一個反應，并形成細胞特征性自身防御反應的分子。特征性自身防御反應的分子。l目前使用的激發(fā)子可分為兩類：目前使用的激發(fā)子可分為兩類：非生物誘導子非生物誘導子（abiotic elicitorabiotic elicitor） 輻射、金屬離子輻射、金屬離子等。等。生物誘導子生物誘導子（biotic elicitorbiotic elicitor） 生物激發(fā)子根據(jù)其來生物激發(fā)子根據(jù)其來源不同又可分為外源性誘導子（源不同又可分為外源性誘導子（exogenous elicitorexogenous elicitor）和內(nèi)源性誘

12、導子（和內(nèi)源性誘導子（endogenous elicitorendogenous elicitor）。）。外源性激發(fā)外源性激發(fā)子多來源于微生物，包括經(jīng)處理的有機體如菌絲，或微子多來源于微生物，包括經(jīng)處理的有機體如菌絲，或微生物機體浸提物以及由微生物產(chǎn)生的多糖類、蛋白質(zhì)類生物機體浸提物以及由微生物產(chǎn)生的多糖類、蛋白質(zhì)類以及脂肪酸類等。內(nèi)源激發(fā)子是來源于植物結(jié)構(gòu)的化合以及脂肪酸類等。內(nèi)源激發(fā)子是來源于植物結(jié)構(gòu)的化合物。如降解細胞壁的酶類、細胞壁碎片、寡聚糖以及其物。如降解細胞壁的酶類、細胞壁碎片、寡聚糖以及其它有機分子。它有機分子。 編輯課件11l 誘導子能增強細胞的呼吸作用誘導子能增強細胞的呼吸

13、作用, , 提供產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的提供產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的 能量能量, , 使細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化使細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, , 利于代謝物的形成、運輸和積累。利于代謝物的形成、運輸和積累。l 目前應用最廣、研究最多的是目前應用最廣、研究最多的是真菌誘導子真菌誘導子, , 如張長平等在如張長平等在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)體系中加入真菌誘導子紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)體系中加入真菌誘導子, , 結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), , 紫杉紫杉醇的合成被加強醇的合成被加強, , 產(chǎn)量得到了顯著提高。產(chǎn)量得到了顯著提高。l 除真菌誘導子外除真菌誘導子外, , 目前在提高植物次生代謝產(chǎn)物方面研究目前在提高植物次生代謝產(chǎn)物方面研究得較多的還包括

14、得較多的還包括寡糖素、茉莉酸類、金屬離子和紫外光寡糖素、茉莉酸類、金屬離子和紫外光等等. .金金屬離子作為誘導子主要有屬離子作為誘導子主要有CuCu2+ 2+ 、CaCa2+ 2+ 、MgMg2+2+等。等。l 孫彬賢等以南方紅豆杉懸浮細胞為材料孫彬賢等以南方紅豆杉懸浮細胞為材料, , 在懸浮細胞中加在懸浮細胞中加入茉莉酸甲酯入茉莉酸甲酯, , 紫杉醇含量提高了紫杉醇含量提高了1010倍。倍。 編輯課件124.3 前體飼喂前體飼喂n 前體指處于目標代謝物代謝途徑中上游的物質(zhì)。上游化合前體指處于目標代謝物代謝途徑中上游的物質(zhì)。上游化合物作為酶的底物，其濃度高低決定了催化反應速度的大小物作為酶的底

15、物，其濃度高低決定了催化反應速度的大小，濃度高則反應速度大。加入前體可以消除關(guān)鍵酶的阻礙，濃度高則反應速度大。加入前體可以消除關(guān)鍵酶的阻礙或阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，利于次生代謝物或阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，利于次生代謝物的生產(chǎn)。的生產(chǎn)。 向銀杏培養(yǎng)基中添加異戊二烯等前體物質(zhì)向銀杏培養(yǎng)基中添加異戊二烯等前體物質(zhì), , 有效地提高了有效地提高了銀杏內(nèi)酯銀杏內(nèi)酯B B 的產(chǎn)量的產(chǎn)量. . 向東北紅豆杉懸浮細胞體系中加入前體物苯丙氨酸和醋酸向東北紅豆杉懸浮細胞體系中加入前體物苯丙氨酸和醋酸鈉，可顯著提高紫杉醇含量且在實驗范圍內(nèi)鈉，可顯著提高紫杉醇含量且在實驗范圍內(nèi), , 隨前體物濃隨前體物濃度的增加促進作用加強度的增加促進作用加強. . n 添加的前體物種類、濃度和時間對次生代謝產(chǎn)物的影響在添加的前體物種類、濃度和時間對次生代謝產(chǎn)物的影響在很多細胞培養(yǎng)中也得到體現(xiàn)。很多細胞培養(yǎng)中也得到體現(xiàn)。編輯課件13