微生物肥料實驗用培養(yǎng)基技術(shù)條件

1、微生物肥料實驗用培養(yǎng)基技術(shù)條件（NY/T 1114-2006）1范圍本標準規(guī)定了微生物肥料實驗室使用的培養(yǎng)基技術(shù)要求。本標準適用于微生物肥料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗、菌種培養(yǎng)與保藏用培養(yǎng)基的制備。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 19524.1-2004   肥料中糞大腸菌群的測定NY 527-2002   

2、60;     光合細菌菌劑3術(shù)語和定義培養(yǎng)基 medium由人工配制的適合微生物生長、代謝、繁殖和保存的營養(yǎng)基質(zhì)。4培養(yǎng)基制備流程圖（略）5培養(yǎng)基選用原則5.1含有滿足所培養(yǎng)的微生物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)。5.2各種營養(yǎng)物質(zhì)要有合適的比例和濃度。5.3有合適的pH范圍和一定的緩沖pH能力。5.4有一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。5.5對于特殊用途的培養(yǎng)基，除遵循以上原則外，還應滿足以下要求：5.5.1在選擇培養(yǎng)基中，應加入利于目的微生物生長而抑制其它微生物生長的化學物質(zhì)。5.5.2菌種保藏培養(yǎng)基選用原則5.5.2.1對于產(chǎn)芽孢或孢子的

3、菌種保藏培養(yǎng)基應以易產(chǎn)生芽孢或孢子為原則。5.5.2.2對于自養(yǎng)微生物的菌種保藏培養(yǎng)基應只使用無機鹽類，不使用有機物。5.5.2.3對能利用無機氮源的微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中不宜使用有機氮源。5.5.2.4對營養(yǎng)缺陷型微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中必須含有該缺陷所需的物質(zhì)。5.5.2.5對耐某種藥物的微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中應含有一定濃度的該種藥物。6要求6.1材料6.1.1用于配制培養(yǎng)基的化學試劑純度至少為化學純。6.1.2試劑出現(xiàn)顏色改變、沉淀、混濁、吸潮結(jié)塊的現(xiàn)象時，不宜使用。6.1.3天然原材料應質(zhì)量穩(wěn)定，未發(fā)生霉變、生蟲和變質(zhì)。6.1.4瓊脂凝固后應具有良好的透明度。6.2器皿6.2

4、.1配制試劑所用的器皿應潔凈。6.2.2盛裝培養(yǎng)基的器皿應由對微生物無毒害并耐高溫的材料制成。6.2.3材料需加熱溶解時，可選用玻璃容器、搪瓷缸和不銹鋼容器等，禁用銅制、鋁制和鐵制容器。6.3棉塞或硅膠塞6.3.1不應使用脫脂棉制作棉塞。6.3.2使用棉塞或硅膠塞時，將其長度的2/3塞入容器內(nèi)。要求松緊適當，緊貼管壁。6.3.3滅菌時，棉塞外要加包牛皮紙或耐高溫透氣塑料薄膜，以防止滅菌時棉塞受潮或進水。6.4培養(yǎng)基配制6.4.1材料稱量6.4.1.1根據(jù)培養(yǎng)基配方，準確稱取相應材料的量。6.4.1.2當配方中某種成分微量時，可預先將該成分配制成一定濃度的母液，然后按量加入。母液須低溫保存。6.

5、4.2材料溶解6.4.2.1不溶于水的組分應在所需的溶劑中溶解后，再加入到培養(yǎng)基中。6.4.2.2非溶性組分，如CaCO3,應最后加入。6.4.2.3易形成沉淀的組分應分別溶解。6.4.2.4不易溶解的組分應做預處理。加熱溶解過程中一旦出現(xiàn)焦化現(xiàn)象時應棄用。6.4.2.5培養(yǎng)基中含有指示劑或有顏色的試劑時，應在培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)好之后再加入。6.4.3pH測定與調(diào)節(jié)6.4.3.1用精密pH試紙或酸度計測定培養(yǎng)基的pH。6.4.3.2培養(yǎng)基的pH用稀酸或稀堿溶液調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)過程中不可用酸堿溶液反復調(diào)節(jié)。6.4.4分裝裝入三角瓶的培養(yǎng)基體積不應超過其容量的1/2，裝入試管的培養(yǎng)基體積為其容量的1/41/

6、5。分裝過程中防止培養(yǎng)基粘附在瓶口或管口。6.4.5滅菌6.4.5.1高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌控制的條件為121、維持30min。當培養(yǎng)基中含有不耐高溫的組分時，可采用115、維持15min30min。6.4.5.2過濾除菌在無菌條件下，將待除菌溶液經(jīng)濾膜為0.2m的細菌過濾器，達到除菌的目的。適用于易受高溫破壞、失活的物質(zhì)的滅菌，如維生素。6.4.5.3干熱滅菌將待滅菌的器皿，用紙包好或放在特定的容器內(nèi)，置于烘箱中，在160左右保持2h。適用于培養(yǎng)皿等玻璃器皿的滅菌。6.4.6平板和斜面的制備在無菌條件下把冷卻至45左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，平板厚度范圍控制在3mm5mm。制備的斜面長度

7、不超過試管長度的2/5。6.5培養(yǎng)基合格檢驗6.5.1檢查固體培養(yǎng)基濕度。培養(yǎng)基冷凝水過多或干燥出現(xiàn)裂痕時，均不能使用。6.5.2隨機抽取已滅過菌的培養(yǎng)基放入2830培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h，確定無菌生長后方可使用。6.6培養(yǎng)基存放培養(yǎng)基應放在冰箱48保存。經(jīng)過存放的培養(yǎng)基使用前應進行6.5的合格檢驗，合格后方可使用。7微生物肥料常用培養(yǎng)基配方、配制要點和用途微生物肥料常用培養(yǎng)基配方、配制要點和用途參見附錄A。附錄A（規(guī)范性附錄）常用培養(yǎng)基配方A.1營養(yǎng)瓊脂A.1.1成分蛋白胨          

8、;                            10.0 g牛肉膏                     &

9、#160;                3.0 g氯化鈉(NaCl)                                5.0

10、 g瓊脂                                        18.0 g蒸餾水        

11、0;                             1 000 mLpH                    

12、0;                     7.27.5A.1.2配制要點將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌30min。A.1.3用途適用于一般細菌培養(yǎng)和保藏。A.2芽孢桿菌培養(yǎng)基A.2.1成分蛋白胨             

13、                         5.0 g牛肉膏                        

14、60;             3.0 g土壤浸出液                                  250 mL蒸餾水 

15、                                     750mL瓊脂             

16、60;                          18. 0 gA.2.2配制要點土壤浸取液：土壤50g，加水200mL，121滅菌1h，過濾補水至250mL。其他同A.1.2A.2.3用途適用于芽孢桿菌的保藏。A.3阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基A.3.1成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)    

17、0;                      0.2 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                        &#

18、160; 0.2 g氯化鈉(NaCl)                                0.2 g碳酸鈣(CaCO3)             &

19、#160;                 5.0 g甘露醇(C6H14O6)                              

20、10.0 g硫酸鈣(CaSO4·2H2O)                    0.1 g瓊脂                         &#

21、160;              18.0 g蒸餾水                                  

22、0;   1 000 mLpH                                          6.87.0A.3.2配制要點同A.1.2A.3.3用途

23、用于固氮菌的培養(yǎng)。A.4根瘤菌培養(yǎng)基YMA.4.1成分磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                 &#

24、160;        0.2 g氯化鈉(NaCl)                                0.1 g甘露醇(C6H14O6)      

25、;                         10.0 g酵母膏                        &

26、#160;             1.0 g0.5%剛果紅溶液                              5 mL瓊脂    

27、60;                                   18.0 g蒸餾水              

28、0;                       1 000 mLpH                          

29、;                6.87.0A.4.2配制要點將各種營養(yǎng)成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH后，加入剛果紅溶液。再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌30min。A.4.3用途適用于根瘤菌的培養(yǎng)。A.5根瘤菌培養(yǎng)基 = 2 * ROMAN IIA.5.1成分酵母粉             

30、0;                        1.0 g甘露醇(C6H14O6)                       

31、0;       10.0 g土壤浸出液                                  200 mL瓊脂       &

32、#160;                                15.0 g蒸餾水                

33、60;                     800 mLpH                            

34、              7.2A.5.2配制要點土壤浸出液：土壤50g，加水200mL，121滅菌1h，過濾補水至200mL。其他同A.1.2A.5.3用途適用于根瘤菌的保藏和培養(yǎng)。A.6硅酸鹽細菌培養(yǎng)基A.6.1成分蔗糖（C12H22O11）                  

35、60;           5.0 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)                   2.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)            

36、              0.5 g碳酸鈣(CaCO3)                               0.1 g三氯化鐵(FeCl3·6H2O

37、)                        0.005 g瓊脂                         &

38、#160;              18.0 g蒸餾水                                  

39、60;   1 000 mLpH                                          7.58.0A.6.2配制要點先將三氯化鐵配制成5的溶

40、液，按量加入，其他同A.1.2A.6.3用途適用于硅酸鹽細菌的培養(yǎng)。A.7固氮（莖瘤）根瘤菌培養(yǎng)基A.7.1成分乳酸鈉（C3H5O3Na）                           10.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)       

41、60;             1.67 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.87 g氯化鈉(NaCl)     

42、60;                          0.05 g氯化鈣(CaCl2)                     

43、0;         0.04 g三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.004 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)         &#

44、160;                0.1 g酵母膏                                 

45、;     1.0 g瓊脂                                        18.0g蒸餾水    

46、                                  1 000 mLpH               &

47、#160;                          6.87.0A.7.2配制要點先將三氯化鐵配制成4的溶液按量加入，其他同A.1.2。A.7.3用途適用于莖瘤根瘤菌的培養(yǎng)。A.8馬丁培養(yǎng)基A.8.1成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)         &

48、#160;                 1.0 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          10.0 g硫酸鎂(MgSO4·

49、7H2O)                          0.5 g蛋白胨                      

50、0;               5.0 g1%孟加拉紅水溶液                            3.3 mL氯霉素    

51、60;                                 0.1 g瓊脂                &

52、#160;                       18.0 g蒸餾水                         

53、60;            1 000 mLA.8.2配制要點將營養(yǎng)成分用蒸餾水溶解后，按量加入1%孟加拉紅水溶液，氯霉素先用少量乙醇溶解后加到培養(yǎng)基中。再加瓊脂，加熱溶化后分裝。115高壓滅菌20min。A.8.3用途適用于真菌的培養(yǎng)。A.9高氏合成一號瓊脂A.9.1成分硝酸鉀(KNO3)                &#

54、160;               1.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)      &

55、#160;                   0.5 g氯化鈉(NaCl)                            

56、0;   0.5 g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        0.01 g可溶性淀粉(C6H10O5)n                

57、60;         20.0 g重鉻酸鉀（K2Cr2O7）                          0.1 g瓊脂            

58、;                            18.0 g蒸餾水                     &

59、#160;            1 000 mLpH                                   

60、60;      7.27.4A.9.2配制要點淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀,加熱溶解后加入。再加瓊脂，加熱溶化后分裝，121高壓滅菌30min。重鉻酸鉀配制成溶液單獨滅菌，使用時再加入到培養(yǎng)基中。A.9.3用途適用于放線菌的培養(yǎng)。A.10聯(lián)合固氮菌培養(yǎng)基A.10.1成分D-葡萄糖酸鈉(C6H10NaO7)                       5

61、.0 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.4 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                &#

62、160;    0.1 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g酵母膏               

63、60;                      1.0 g氯化鈉(NaCl)                          

64、      0.1 g氯化鈣(CaCl2)                               0.02 g三氯化鐵(FeCl3·6H2O)       

65、0;                0.01 g鉬酸鈉（Na2MoO4）                            0.002 g瓊脂   

66、;                                     18.0 g蒸餾水            &

67、#160;                         1 000 mLpH                       &#

68、160;                  6.87.0A.10.2配制要點將氯化鈣配、鉬酸鈉分別配制成2的溶液，按量加入，其他同A.1.2。A.10.3用途適用于固氮螺菌的培養(yǎng)。A.11馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基A.11.1成分馬鈴薯                

69、60;                     200 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                         

70、 20.0 g瓊脂                                        18.0 g蒸餾水        

71、;                              1 000 mLA.11.2配制要點稱取去皮馬鈴薯200g切塊，放入水中煮沸30min，然后用雙層紗布過濾取汁，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補足水至1000mL，115滅菌20min。A.11.3用途適用于酵母菌的培養(yǎng)。A.12麥芽汁瓊脂A.12.1成

72、分12波林麥芽汁（Brix）                        1 000 mL瓊脂                       

73、;                18.0 gpH                                 &#

74、160;        5.4A.12.2配制要點將麥芽汁調(diào)至12波林的糖度，調(diào)節(jié)pH，加入瓊脂，加熱溶化后分裝。115高壓滅菌20min。A.12.3用途適用于酵母菌的培養(yǎng)和保藏。A.13乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）A.13.1成分蛋白胨                        

75、60;             10.0 g牛肉膏                                    

76、;  10.0 g酵母膏                                      5.0 g檸檬酸氫二銨(NH4)2C6H6O7      &

77、#160;                 2.0 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          20.0 g吐溫80  

78、;                                    1.0 g乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）          

79、           5.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     2.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)           

80、;               0.58 g硫酸錳(MnSO4·H2O)                           0.25 g瓊脂     

81、;                                   18.0 g蒸餾水              &

82、#160;                       1 000 mLpH                         &#

83、160;                6.26.6A.13.2配制要點將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌20min。A.13.3用途適用于乳酸菌的培養(yǎng)。A.14光合細菌培養(yǎng)基 = 1 * ROMAN IA.14.1成分酵母粉             

84、60;                        3.0 g蛋白胨                         

85、             3.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g氯化鈣（CaCl2）      

86、                       0.3 g蒸餾水                          

87、60;           1 000 mLpH                                     

88、0;    6.87.0A.14.2配制要點同A.1.2。A.14.3用途適用于光合細菌的培養(yǎng)。 A.15光合細菌培養(yǎng)基 = 2 * ROMAN IIA.15.1成分；溶液 = 1 * ROMAN I氯化鈣（CaCl2）                          

89、0;  75 mg乙酸鈉（CH3COONa）                          1.6 g煙酸                   &

90、#160;                    40 mg氯化鈉(NaCl)                           

91、0;    1.5 g生物素                                      40 mg酵母膏      

92、0;                               2.0 g硫胺素                  &

93、#160;                   40 mg氯化鎂(MgCl2)                            

94、60;  200 mg乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液               5 mL微量元素溶液                            

95、60;   1 mL蒸餾水                                      800mL溶液 = 2 * ROMAN II磷酸二氫鉀(KH2PO4)  &#

96、160;                        600 mg磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     1.18 g蒸

97、餾水                                      200 mL將溶液 = 1 * ROMAN I、溶液 = 2 * ROMAN II分別于121高壓滅菌15min，冷卻后將溶液&#

98、160;= 1 * ROMAN I、溶液 = 2 * ROMAN II混勻。微量元素溶液：乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8·2H2O）        2.0 g硼酸（H3BO3）                          

99、0;     100 mg氯化鋅（ZnCl2）                             100 mg高鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）          

100、;          20 mg氯化銅（CuCl2）                             10 mg硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)     

101、0;                  2.0 g氯化鈷（CoCl2·6H2O）                        100 mg氯化錳（MnCl2·4H2O） 

102、0;                      100 mg氯化鎳（NiCl2·6H2O）                        20 mg亞

103、硒酸鈉（Na2SeO3）                                             1 mg蒸餾水  

104、;                                    1 000 mL乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液:乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Na2）         

105、         20.0 g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        20.0 g蒸餾水            

106、0;                         1 000 mLA.15.2配制要點乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液需要通氣過夜，維生素類物質(zhì)要過濾除菌后按量加入到培養(yǎng)基中。A.15.3用途適用于光合細菌的培養(yǎng)。A.16乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(用于大腸菌群初步發(fā)酵)A.16.1成分蛋白胨     

107、60;                                20.0 g    豬膽鹽             

108、;                         5.0 g    乳糖                    

109、60;                   10.0 g0.04%溴甲酚紫溶液                           25.0 mL    蒸餾水                                      1 000 mL  &