血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)

1、整理ppt1血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）整理ppt2主要內(nèi)容o一、基本概念o二、HA和HI實驗在禽病診斷中的作用o三、基本操作o四、注意事項整理ppt3一、基本概念o1、血凝試驗(HA)o1.1 定義o某此病毒或病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝(hemagglutination，HA)，也稱直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝試驗 (HA) 。o常見于正粘病毒（如AIV）、副粘病毒（如NDV）和某些黃病毒（如JEV）、痘病毒、以及經(jīng)過處理過后的IBV。整理ppt4o1.2 血凝類型：o(1) 可逆轉(zhuǎn)型o血凝素與病毒顆粒易分開，

2、經(jīng)超速離心后，病毒顆粒沉淀于管底，血凝素則游離于上清液內(nèi)。這種血凝素凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象是可逆的，即被凝集的紅細(xì)胞釋放了吸附于表面的血凝素后，可再與該血凝素發(fā)生凝集。o如天花、鼠疫等病毒。整理ppt5o(2) 不可逆轉(zhuǎn)型o血凝素與病毒顆粒結(jié)合得比較緊密，不經(jīng)過特殊處理血凝素不能與病毒顆粒分開，這種病毒引起的紅細(xì)胞凝集，是不可逆轉(zhuǎn)的。在一定的溫度 (37)下，病毒釋放出一種能破壞紅細(xì)胞表面受體糖苷鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸酶，當(dāng)病毒顆粒從紅細(xì)胞表面游離出來后紅細(xì)胞表面受體已被破壞而失去了再凝集病毒的能力。o如流感病毒、雞新城疫病毒等。 整理ppt6o(3) 凝集條件嚴(yán)格型o有些病毒及其血凝素凝集紅細(xì)胞的條

3、件很嚴(yán)格，不僅對不同種動物的紅細(xì)胞有嚴(yán)格的選擇，即是對同種動物，由于性別和年齡的不同，對紅細(xì)胞的凝集性能亦有差異（如JEV對公鵝的紅細(xì)胞凝集性能比對經(jīng)產(chǎn)老齡母鵝的紅細(xì)胞凝集性能好） 。除此之處，還對緩沖液的pH值、溫度及鹽濃度等的要求均很嚴(yán)格。整理ppt7o1.3 原理o血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:o痘病毒對雞的紅細(xì)胞發(fā)生凝集并非是病毒本身，而是痘病毒的產(chǎn)物-類脂蛋白的作用。o流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素與紅細(xì)胞表面的受體糖蛋白相互吸附而發(fā)生的。 整理ppt8整理ppt9o2、血凝抑制試驗(HI) o2.1定義o當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒

4、或其血凝素，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|。這時紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝試驗 (HI) 。o該試驗是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法。 整理ppt10o2.2原理o特異性抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合，使病毒失去凝集紅細(xì)胞的能力，從而抑制血凝現(xiàn)象。整理ppt11二、HA和HI實驗在禽病診斷中的作用o1、用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鑒定 o根據(jù)抗原與相應(yīng)抗體的特異性中和反應(yīng)原理，給未知病毒懸液中加入已知的抗禽流感病毒陽性血清或已知的

5、抗新城疫病毒陽性血清，相應(yīng)病毒便喪失了其凝集紅細(xì)胞的能力。因此，可利用從發(fā)病的雞、鴨、鵝體內(nèi)分離的病毒作HA和HI試驗。病毒懸液能凝集紅細(xì)胞，并且能被已知的抗血清（陽性血清）所抑制，那么該病毒即是已知陽性血清相對應(yīng)的病毒。如用新城疫陽性血清完全抑制了未知病毒培養(yǎng)物的血凝性，那么，這個未知病毒培養(yǎng)物就是新城疫病毒；如果病毒懸液雖然能凝集雞紅細(xì)胞，但不能被雞新城疫血清所抑制，說明不是雞新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。 整理ppt122、HI試驗可用于發(fā)病禽群的診斷 雞、鴨、鵝規(guī)?；B(yǎng)殖中雖進行相關(guān)疫病疫苗的免疫，但往往有部分家禽由于各種原因免疫力水平達不到要求，因而造成某些傳染病的流行。由于

6、免疫禽群發(fā)病時臨床癥狀和病變不典型，給確診帶來困難。采用HI試驗對雞群中禽流感、新城疫等抗體進行測定，依據(jù)抗體滴度的高低和離散性有助于診斷。例如：經(jīng)新城疫活苗加滅活苗免疫過的雞群，新城疫抗體水平平均為7Log28Log2，最高為10Log2。而新城疫感染雞群中HI抗體部分高達11Log213Log2；就抗體分布而言，雞新城疫免疫雞群抗體水平呈正態(tài)分布，HI抗體在10Log2以上者僅占10以下，4Log2以下者在1以下。而感染了新城疫強毒并出現(xiàn)發(fā)病的雞群，HI抗體中10Log2以上者占25以上，而4oLg2以下者在1030之間。因此，依據(jù)禽群的抗體水平高低和分布，結(jié)合臨床癥狀和病、死雞的剖檢變化

7、，可診斷禽群是否患有新城疫或禽流感等。 整理ppt133、對禽群的免疫狀態(tài)進行評價 禽群或個體血清中的HI抗體水平與疫苗的免疫和對相應(yīng)強毒侵襲的抵抗力都有密切關(guān)系。以新城疫為例，當(dāng)HI抗體在7Log2以上進行活苗免疫時，由于高抗體可中和絕大部分的疫苗病毒，產(chǎn)生的免疫力很弱；HI抗體在5Log26Log2時，活苗免疫效果也受到一定的干擾；當(dāng)HI抗體在4Log2以下時，活苗免疫效果良好，但對強毒感染抵抗力下降。一般認(rèn)為，成年雞新城疫的HI抗體水平在5Log2以上時，保護率在90以上，4Log2以下時只有50的雞對強毒有抵抗力，2Log2以下時80以上的雞易感染新城疫。由于雛雞母源抗體對疫苗首次免疫

8、效果影響很大，了解母源抗體水平對疫苗免疫有重要意義。研究表明，母雞血清抗體、卵黃抗體和5日齡雛雞母源抗體三者之間有相關(guān)性，卵黃抗體與母雞血清抗體基本一致，而1日齡雛雞血清抗體低于卵黃抗體一個滴度，可檢測種雞卵黃抗體、估測1日齡雛雞母源抗體水平。 雛雞新城疫母源抗體半衰期約為5天，免疫臨界點為3Log2，這樣可依據(jù)抗體水平，確定最佳免疫時間。 整理ppt14三、實驗步驟（以禽流感為例，參照禽流感防治技術(shù)規(guī)范） o1 阿氏（Alsevers）液配制o稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min

9、高壓滅菌，4保存?zhèn)溆?。整理ppt152 1%雞紅細(xì)胞液的制備2.1采血 用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規(guī)試驗證明體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約24mL，與阿氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。2.2 洗滌雞紅細(xì)胞 將離心管中的血液經(jīng)15001800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)15001800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過程后，加入阿氏液20 mL，輕輕混合成紅細(xì)胞懸液，4保存?zhèn)溆?，不超過5天。2.3 10%雞紅細(xì)胞懸液 取阿氏液保存不超過5

10、天的紅細(xì)胞，在錐形刻度離心管中離心15001800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的PBS，用吸管反復(fù)吹吸使PBS與紅細(xì)胞混合均勻。2.4 1%雞紅細(xì)胞液 取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，加入9 mLPBS，混合均勻即可。整理ppt163 抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）3.1 在微量反應(yīng)板的1孔12孔均加入25LPBS，換滴頭。3.2吸取25L病毒懸液加入第l孔，混勻。3.3從第1孔吸取25L病毒液加入第2孔，混勻后吸取25L加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取25L棄之，換滴頭。3.4每孔再加入25

11、L PBS。3.5每孔均加入25L體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）3.6振蕩混勻，在室溫（2025）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下反應(yīng)1小時）。對照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。整理ppt173.7結(jié)果判定 將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果將板傾斜（45度左右），觀察血凝板，判讀結(jié)果： +：紅細(xì)胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細(xì)胞凝集：紅細(xì)胞凝集基本同上，但孔底有大圈：紅細(xì)胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊： 紅細(xì)胞于孔底形成小圓點，四周有少許凝集塊 ：紅細(xì)胞于孔底呈小圓點，邊緣光滑整齊，即紅細(xì)胞完全不凝集 能使紅細(xì)胞完全凝集（1

12、00%凝集，+）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。 注意！ 對照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗無效整理ppt184、血凝抑制試驗（HI試驗 微量法）4.1 根據(jù)3的試驗結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。4.2 在微量反應(yīng)板的1孔11孔加入25L PBS，第12孔加入50L PBS。4.3 吸取25L血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25L于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取

13、25L棄去。4.4 1孔11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液25L，室溫（約20）靜置至少30min。4.5 每孔加入25L體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20，若環(huán)境溫度太高可置4條件下進行），對照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。4.6 結(jié)果判定以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。HI價小于或等于21og2判定HI試驗陰性；HI價等于31og2為可疑，需重復(fù)試驗；HI價大于或等于41og2為陽性。整理ppt19四、注意事項o目前在禽流感血凝抑制試驗方

14、面存在很多問題，會對血凝抑制試驗的意義造成影響從而導(dǎo)致不正確的結(jié)果。整理ppt201、注意抗原相的差異o實踐中，經(jīng)常會出現(xiàn)不同廠家生產(chǎn)的相同亞型的禽流感抗原所測同一血清的血凝抑制價不同，這是由于禽流感病毒變異較快，存在抗原相的差異。o禽流感病毒株按其血凝抑制試驗中所表現(xiàn)的親和力不同而分為三種類型：對本株和異株免疫血清均呈較高效價的為“R”相；對本株效價高對異株低的為“P”相；對本株及異株均低的為“Q”相。o如果在試驗中出現(xiàn)相的差異，所測結(jié)果會相差2-3個滴度，所以在血凝抑制試驗操作時，挑選親和相毒株作為測定抗原較好，這樣會提高診斷的靈敏度 。整理ppt212、注意消除非特異性因素o禽類血清中，

15、尤其是水禽血清，往往含有非特異性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制試驗時會出現(xiàn)2-3孔有凝集現(xiàn)象。o因此，在利用血凝抑制試驗進行血清抗體測定之前，有必要對血清中非特異性因子進行排除。整理ppt22常用消除方法（FAOFAO推薦）推薦）o1 1、雞的紅細(xì)胞吸附法、雞的紅細(xì)胞吸附法o1.1試劑o雞的紅細(xì)胞：要充分洗滌；oPBS： pH7.5，4保存；o陽性對照血清；o陰性對照血清。o1.2方法o加入25L雞的紅細(xì)胞到100L血清中；o4，用微量振蕩器振蕩20-30min；o加入100L滅菌PBS (用RDE處理的血清除外)；o4000轉(zhuǎn)離心1min；o取出上清，進行HI試驗；o用陽性對照血清和陰性對

16、照血清驗證處理的徹底性o用于消除除雞以外的其它禽類的血清非特異性反應(yīng)。整理ppt23o2 2、RDERDE（受體裂解酶）消除法（受體裂解酶）消除法o2.1試劑：oRDE：用20mL無菌PBS稀釋，小量分裝，-20保存一周，注意避免反復(fù)凍融；oPBS： pH7.5，4保存；o陽性對照血清；o陰性對照血清。o2.2方法：o2.2.1雞血清o加3倍體積的RDE到1倍體積的血清中；o充分混合；o56水浴30-60min;o加入6倍體積于血清體積的PBS。o2.2.2其它禽類血清o依據(jù)用RDE處理雞血清方法處理后，繼續(xù)按下列方法進行：用25-5L雞的紅細(xì)胞到500L血清中；4，用微量振蕩器振蕩20-30

17、min；4000轉(zhuǎn)離心1min。整理ppt24o3 3、 熱滅活法熱滅活法o3.1雞血清o取100L血清樣品放入一滅菌離心管中；o各取100L陽性血清和陰性血清加入到另2個滅菌離心管中；o56水浴30min。o3.2 其它禽類血清o血清用雞的紅細(xì)胞處理后，分別取100L樣品、陽性血清、陰性血清放入滅菌離心管中，56水浴30min。o熱滅活是一種排除非特異性因子的有效方法，但對特異性抗體破壞較大。 整理ppt25o采用1% 同源禽種紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞進行水禽血清抗體效價測定，將結(jié)果降低1個滴度作為測定結(jié)果（朱燕秋等中國獸醫(yī)雜志2009，45（2）42-43）。整理ppt263、注意抗原的標(biāo)定o在

18、禽流感血凝抑制試驗中抗原標(biāo)定至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)?？乖渲仆旰螅鑼λ渲频目乖M行標(biāo)定，看所配制的抗原是否達到所需標(biāo)準(zhǔn)，如工作抗原效價過高或過低對結(jié)果都有一定的影響。過高，測定抗體效價偏低；過低，測定效價過高，甚至很高。所以在禽流感血凝抑制試驗中必須對抗原進行標(biāo)定。整理ppt27整理ppt284、注意嚴(yán)格規(guī)范操作o在進行試驗操作時很容易出現(xiàn)錯誤，所以進行實驗時一定要嚴(yán)格操作，每次測定應(yīng)有嚴(yán)格的溫度范圍和作用時間，出現(xiàn)錯誤時要認(rèn)真查找原因，以免類似錯誤再次出現(xiàn)。o以下是容易出現(xiàn)的錯誤：整理ppt29o（1）對照孔凝集o鹽類凝集：所謂鹽類凝集即稀釋液中氯化鈉達至一定高濃度時，即使沒有血清抗體也能發(fā)生凝集反應(yīng)。o當(dāng)生理鹽水被細(xì)菌污染時也可出現(xiàn)對照孔凝集。o血清變質(zhì)或受細(xì)菌污染。整理ppt30o（2）全部凝集o當(dāng)紅細(xì)胞受細(xì)菌污染或保存時間過長可出現(xiàn)此現(xiàn)象。o抗原滴加時出現(xiàn)失誤，工作抗原效價過高。o生理鹽水受細(xì)菌污染或其它因素.整理ppt31o（3） 紅細(xì)胞全部下滑o 當(dāng)配制抗原時，配制工作抗原效價過低，不足以凝集雞紅細(xì)胞。o 加樣時所有孔全部加成生理鹽水亦出現(xiàn)全部下滑現(xiàn)象。整理ppt32o（4）不同來源、不同濃度的紅細(xì)胞會使結(jié)果差異很大，所以紅細(xì)胞來源一定要相同：o一般需要3只或3只以上公雞來提供紅