酶工程電子教案酶細胞原生質(zhì)體固定化酶的一些不足之處

1、酶工程電子教案第五章 酶、細胞、原生質(zhì)體固定化酶的一些缺乏之處：( 1)酶的穩(wěn)定性較差(2) 酶的一次性使用(3) 產(chǎn)物的別離純化較困難改善方法之一就是固定化技術的應用 :(1) 固定化酶是指固定在一定載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催化反響的酶。固定化 酶既保持了酶的催化特性， 又克服了游離酶的缺乏之處， 具有增加穩(wěn)定性， 可反復或連續(xù)使 用以及易于和反響產(chǎn)物分開等顯著優(yōu)點。(2) 固定化細胞是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。也稱為 固定化活細胞或固定化增值細胞。通常只能用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。(3) 固定化原生質(zhì)體技術，有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌。1. 酶固定化 采用各種

2、方法，將酶與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定 在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催化反響的酶稱為固定化酶。固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為固定化菌體，它是固定化酶的一種形式。1.1 酶的固定化方法固定化的方法：吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法和熱處理法等。(1) 吸附法： 利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其外表上，而使酶固定化的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。物理吸附法常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限 制。(2) 包埋法將酶或含酶菌體包埋在

3、各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、 光交聯(lián)樹脂、聚酰胺、火棉膠等。包埋法制備固定化酶或固定化菌體時，根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為凝膠包埋法和 半透膜包埋法兩大類。凝膠包埋法：凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀 的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數(shù)為球狀或片狀，也可按需要制成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、 海藻酸鈣凝膠、 角叉菜膠、 明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝 膠、光交聯(lián)樹脂等合成凝膠。半透膜包埋法：半透膜包埋法是將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定 化

4、酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等。(3) 結(jié)合法選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學鍵不同，結(jié)合法可分為離子鍵結(jié)合法和共價鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子鍵結(jié)合法。 離子鍵結(jié)合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有DEAE- 纖維素、 TEAE- 纖維素、 DEAE- 葡聚糖凝膠等。共價鍵結(jié)合法：通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價鍵結(jié)合法。共價鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基 酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可

5、以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使載體活化，即借助于某種方法，在載體上引進 一活潑基團。然后此活潑基團再與酶分子上的某一基團反響，形成共價鍵。使載體活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。(4) 交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián) 法。交聯(lián)法也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的 是戊二醛。(5) 熱處理法將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間， 使酶固定在菌體內(nèi)， 而制備得到固定化菌體。

6、 熱處理法只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在加熱處理時，要嚴格控制好加熱溫 度和時間，以免引起酶的變性失活。1.2 固定化酶的特性(1) 穩(wěn)定性 :固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。(2) 最適溫度 : 固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。(3) 最適 pH 值: 酶經(jīng)過固定化后，其作用的最適 pH 值往往會發(fā)生一些變化。影響固定化酶最適 pH 值的因素主要有兩個，一個是載體的帶電性質(zhì)，另一個是酶催化反響產(chǎn)物的性質(zhì)。4底物特異性 : 固定化酶的底物特異性與游離酶比擬可能有些不同， 其變化與底物分子量的 大小有一定關系。 對于那些作用于低分子底物的酶， 固定化

7、前后的底物特異性沒有明顯變化。固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。1.3 固定化酶的應用固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的缺乏之處，具有如下顯著的優(yōu)點：1酶的穩(wěn)定性增加， 減少溫度、 pH 值、有機溶劑和其他外界因素對酶的活力的影響， 可以較長期地保持較高的酶活力。2固定化酶可反復使用或連續(xù)使用較長時間，提高酶的利用價值，降低生產(chǎn)本錢。3固定化酶易于和反響產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的別離純化，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量。固定化酶已廣泛地應用于食品、輕工、醫(yī)藥、化工、分析、環(huán)保、能源和科學研究等領 域。2. 細胞固定化通過各種方法將細胞與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化細胞的過程

8、稱為細胞固定化。 固定化活細胞或固定化增殖細胞 微生物細胞、植物細胞和動物細胞都可以制成固定化細胞。2.1 細胞固定化的方法主要可分為吸附法和包埋法兩大類方法。1吸附法利用各種固體吸附劑，將細胞吸附在其外表而使細胞固定化的方法稱為吸附法。用于細胞固定化的吸附劑主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金屬絲網(wǎng)、微載體和中空纖維等。(2) 包埋法將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部而制成固定化細胞的方法稱為包埋法。包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。以各種多孔凝膠為載體，將細胞包埋在凝膠的微孔內(nèi)而使細胞固定化的方法稱為凝膠 包埋法。O凝膠包埋法是應用最廣泛的細胞固定化方法，適用于各種微生物、動物和植物

9、 細胞的固定化。O凝膠包埋法所使用的載體主要有瓊脂、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺 凝膠和光交聯(lián)樹脂等。2.2 微生物細胞固定化2.2.1 固定化微生物細胞的特點： 固定化微生物細胞保持了細胞的完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好。 固定化微生物細胞保持了細胞內(nèi)原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，可以按照 原來的代謝途徑進行新陳代謝，并進行有效的代謝調(diào)節(jié)控制。 發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復使用或者連續(xù)使用較長的一段時間。 固定化微生物細胞密度提高，可以提高產(chǎn)率。 提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性，2.2.2 固定化微生物細胞的應用主要用在兩個方面：是利用固定化微生物細胞發(fā)酵生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物。 二是利用固定化

10、微生物細胞與各種電極結(jié)合制成微生物電極。(1) 利用固定化微生物生產(chǎn)各種產(chǎn)物2固定化微生物細胞制造微生物傳感器2.3 植物細胞固定化2.3.1 固定化植物細胞的特點：1植物細胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護作用，可減輕剪切力和其他外界因素對 植物細胞的影響，提高植物細胞的存活率和穩(wěn)定性。2細胞經(jīng)固定化后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動，不容易聚集成團。3固定化植物細胞發(fā)酵可以簡便地在不同地培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液，即首先在 生長培養(yǎng)基中生長增殖， 在到達一定的細胞密度后， 改換成發(fā)酵培養(yǎng)基， 以利于生產(chǎn)各種所 需的次級代謝物。4固定化植物細胞可反復使用或連續(xù)使用較長的一段時間，大大縮短生產(chǎn)

11、周期，提 高產(chǎn)率。5固定化植物細胞易于與培養(yǎng)液別離，利于產(chǎn)品的別離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。2.3.2 植物細胞固定化的方法 ：植物細胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法兩種。吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或者將植物細胞吸附在中空纖 維的外壁上。包埋法是將植物細胞包埋在瓊脂、角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、明膠 等多孔凝膠之中。包埋方法與微生物細胞包埋時根本相同。2.3.3 固定化植物細胞的應用：固定化植物細胞的主要用途是制造人工種子，就有可能獲得大量具有相同遺傳特性的 植株。對種質(zhì)的保存具有重要意義。并可以節(jié)約種子的用量。固定化植物細胞還可以用于生產(chǎn)各種色素、香精、藥物、酶

12、等次級代謝物。2.4 動物細胞固定化2.4.2 固定化動物細胞的特點 ：1提高細胞存活率：動物細胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護作用，可以減輕或免 受剪切力的影響， 同時動物細胞可附著在載體外表生長， 從而可顯著提高動物細胞的存活率。 2提高產(chǎn)率：動物細胞固定化后，可先在生長培養(yǎng)基中生長繁殖，使細胞在載體上 形成最正確分布并到達一定的細胞密度。 然后可簡便地改換成發(fā)酵培養(yǎng)基， 控制發(fā)酵條件， 使 細胞從生長期轉(zhuǎn)變到生產(chǎn)期，以利于提高產(chǎn)率。3固定化動物細胞可反復使用或連續(xù)使用較長的時間。例如，中國倉鼠卵巢細胞CHO 生產(chǎn)人干擾素可以穩(wěn)定地生產(chǎn)30 天。4固定化細胞易于與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)物別離純化，

13、提高產(chǎn)品質(zhì)量。2.4.2 動物細胞固定化方法 ：動物細胞固定化地方法有吸附法和包埋法兩種。1吸附法：大多數(shù)動物細胞屬于附著細胞，它們在培養(yǎng)過程中，必須趨向于附著在固體外表。故 此吸附法特別適合于動物細胞的固定化。轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成，外表經(jīng)過一定方法處理而帶上電荷。微載體是指顆粒細小的固定化載體，直徑一般為100200 g，相對密度接近1.0。是由帶有外表電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。微 載體已用于多種動物細胞的固定化；中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成。2包埋法包埋固定化法一般適用于懸浮細胞。根據(jù)載體和方法的不同，有凝膠包埋法、半透膜包埋法

14、兩種。 凝膠包埋法： 利用各種多孔凝膠為載體將動物細胞固定化。 細胞被固定在凝膠的微孔 中生長繁殖和新陳代謝， 由于有載體的保護， 動物細胞有較好的穩(wěn)定性， 可顯著提高其存活 率。用于動物細胞固定化的凝膠載體主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白等。 半透膜包埋法： 利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋，形成微囊型固定化動物細胞。2.4.3 固定化動物細胞的應用 ：動物細胞中大局部為貼壁細胞， 需要 貼附在載體的外表才能正常生長。 所以固定化動物 細胞廣泛應用。特別是采用微載體對動物細胞進行吸附固定化。3. 原生質(zhì)體固定化 固定化原生質(zhì)體的制備主要包括原生質(zhì)體的制備和原生質(zhì)體固定化兩

15、個階段。3.1 原生質(zhì)體的制備 不同種類的細胞，由于各自細胞壁的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，原生質(zhì)體的制備方法也 不一樣。原生質(zhì)體的制備過程是首先將對數(shù)生長期的細胞收集起來，懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑 的高滲緩沖液中。 然后參加適宜的細胞壁水解酶， 在一定的條件下作用一段時間， 使細胞壁 破壞。別離除去細胞壁碎片、未作用的細胞以及細胞壁水解酶，而得到原生質(zhì)體。除去細胞壁所使用的酶應根據(jù)細胞壁的主要成分的不同而進行選擇。細菌的細胞壁主要成分是肽多糖，所以細菌原生質(zhì)體制備時主要采用從蛋清中得到的 溶菌酶；酵母細胞壁主要由B -葡聚糖構(gòu)成，故采用B -1, 3-葡聚糖酶;霉菌的細胞壁組分比擬復雜，除含有幾丁質(zhì)

16、外，還有其他多種組分，故要去除霉菌的細胞壁，那么需有幾丁質(zhì)酶與其他有關酶共同作用。植物細胞壁由纖維素、半纖維素和果膠組成，故制備植物原生質(zhì)體時主要應用纖維素 酶和果膠酶。為防止制備得到的原生質(zhì)體破裂，應參加適當?shù)臐B透壓穩(wěn)定劑。如：無機鹽、糖類、 糖醇等化合物。應選擇對數(shù)生長期的細胞制備原生質(zhì)體，以獲得較高的原生質(zhì)體形成率。所加進的細胞壁溶解酶的種類和濃度、酶作用溫度， pH 值以及作用時間等對原生質(zhì) 體的制備都有明顯影響，必須經(jīng)過試驗確定其最正確條件。3.2 原生質(zhì)體固定化采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。原生質(zhì)體固定化一般采用凝膠包埋法。常用的凝膠有：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角 叉菜膠和光交聯(lián)樹脂等。3.3 固定化原生質(zhì)體的特點：(1) 固定化原生質(zhì)體由于解除了細胞壁這一擴散屏障，可增加細胞膜的通透性，有利于 氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收，也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，可顯著提高產(chǎn)率。(2) 固定化原生質(zhì)體由于有載體的保護作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可 反復使用和連續(xù)使用較長的時間， 利于連續(xù)化生產(chǎn)。 在冰箱保存較長時間后仍能保持其生產(chǎn) 能力。(3) 固定化原生質(zhì)體易于和發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的別離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。