熒光光譜分析法121220.

1、熒光分析法第一節(jié)熒光分析法的基本原理第二節(jié)熒光定量分析方法第三節(jié)熒光分光光度計(jì)下村修:現(xiàn)年80歲的下村修1928 年出生于可本京都府.1960年 茨得名古屋丸學(xué)理學(xué)晦士學(xué)伐后 赴其，丸后卷美餌普林斯頓大學(xué). 冰士頓丸學(xué)和伍査霍余海洋生楊 實(shí)臉?biāo)ぷ?。?962年從一科由于嫌色 發(fā)岀埒艷嫌木母中發(fā)現(xiàn)了挖光認(rèn)譽(yù)為生楊發(fā)光研屯第一人。馬丁沙余菲：馬丁沙余菲出生于1947年，現(xiàn)年61歲，是美倒哥倫 比亞大學(xué)生楊學(xué)教授。他獲樊的主要貢故&.于句人們展示了綠色 關(guān)光妥倉作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用，這一技術(shù)彼廣臣運(yùn)用于生 理學(xué)和氐學(xué)等領(lǐng)城。鶏典宣家科學(xué)fit壹布，美籍華裔科學(xué)家微永健、美國生腸學(xué)家馬

2、丁沙余菲和Q本有機(jī)化學(xué)家兼海洋生揚(yáng)學(xué)家下村修共同荻得2008 年度諾貝余化學(xué)獎.將均分1000萬瑞典克胡C約金140萬美元丿典 僉。犁助他們獲獎的是綠色集光餐勺。這科餐自為生揚(yáng)與醫(yī)學(xué)實(shí)臉 帶來革4，它發(fā)岀的炭光像一養(yǎng)碉燈，率助研克人員照売生Q體農(nóng) 分子屋面和細(xì)胞層而的詰多反應(yīng)。瞻2008年諾貝余化學(xué)獎般 2螢石(fluospar)而得名。亠1婁石(綠)某些物質(zhì)被一定波長的光照射時，會在一定時 間內(nèi)發(fā)射出波長比入射光長的光，如果這個時間比 較短，這種光就稱為熒光。熒光由一種能發(fā)熒光的 礦物我們這里要介紹的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外 光和可見光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒 光。除了紫外光和可見

3、光可能激發(fā)熒光外，其它的光如紅外光.X射線也可能激發(fā)出熒光，因此除紫 外熒光或可見熒光外，還有紅外熒光、X射線熒光 等。 ,ooSR-GL10NECKLACESR-GL01x 580mm 5a， aeorax 5®0«nm澳大利亞科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn) ,一種叫“螳螂蝦”的海 里動物通過發(fā)出色彩鮮艷 的熒光來恐嚇警告敵對者 或者吸引性配偶。用熒光抗體染色之 原生動物K. Bretc et al. PNAS 94 (1997) 2306green-fluorescent protein (GFP)光致發(fā)光（二級光）。光致發(fā)光某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長的光之外，發(fā)射出 比原來所

4、吸收光的波長更長的光熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線的位置及其強(qiáng)度進(jìn) 行物質(zhì)鑒定和含量測定的儀器方法。光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外（真空紫外）近紫外可見光近紅外中紅外遠(yuǎn)紅外10nm200nm200nm380nm780 nm380nm 780nm 2.52.5 gm50 pn50)ini300 gm分子熒光分析的特點(diǎn):1. 靈敏度高：一般紫外一可見分光光度法的檢出限約 為107g/mI,而熒光分析法的檢出限可達(dá)到10-10甚至 10 ,2g/mlo2. 選擇性好3.線性范圍寬4.應(yīng)用范圍第一節(jié)熒光分析法的基本原理一、分子熒光molecular fluorescence1.分子熒光的產(chǎn)生分子能級比原子能級復(fù)雜在

5、分子體系中，每個電子能級上都存在振動、轉(zhuǎn)動能層室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能層在基態(tài)時，含有偶數(shù)個電子的分子，電子的叫為+1/2和 1/2, *0, M=lo則該分子所處的電子能態(tài)稱為基態(tài)單重態(tài), 用符號S。表示£T激發(fā)態(tài)分子吸收輻射后基態(tài) 一! !基態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)T電千自旋狀態(tài)t |電子被激發(fā)且不發(fā)生自旋方向的改變叫為+1/2和-1/2,5=0, M=lo則該分子所處的電子能態(tài)稱為 激發(fā)單重態(tài),用符號S表示。（S S2 S3.）電子被激發(fā)且伴隨著自旋方向的改變叫為+1/2和+1/2,5=1, M=3o則該分子所處的電子能態(tài)稱為 激發(fā)三重態(tài)，用符號卩表示。（7 T2）1

6、1£T£T小結(jié)：分子能級與躍遷基態(tài)（S°）T激發(fā)態(tài):吸收特定頻率的輻射;量子化；躍遷£T次到位;激發(fā)態(tài)-基態(tài)：多種途徑和方式（見能級);速度最快、激£T發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢，發(fā)生的幾率大;第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài)S2； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài)卩八T2.；電子能級的多重性Af=2S+l平行自旋比成對自旋穩(wěn)定（洪特規(guī)則），三重態(tài)能級比相 應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；12小結(jié)：激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的不同獵激發(fā)單重態(tài)分子中沒有凈電子自旋,而具有反磁性;激發(fā)三重態(tài)有2個自旋平行電子，是順磁性的激發(fā)單重態(tài)分子平均壽命短(10

7、10-),而激發(fā)三重態(tài) 的長(1010s)朱基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)，不涉及電子自旋方向的 改變而容易發(fā)生，屬于允許躍遷；而到激發(fā)三重態(tài)屬于禁阻 躍遷50->51、S2允許躍遷;S0->Tn T2禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級進(jìn)入的幾率小;);能量吸收發(fā)射熒光S/SC2S.換發(fā)射磷光振動弛豫V激發(fā)態(tài)T基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射 躍遷（發(fā)光）和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑熒光:10710s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級-基態(tài) 磷光：ms；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)”輻射和非輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級中，以熱能量交

8、換形式由高振動能 層至低相鄰振動能層間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12S 內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的電子能級間的等能級的無輻射躍遷。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激 發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時間lOSo熒光發(fā)射=電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能層T基態(tài)（熒光多為躍遷），發(fā)射波長為入的熒光，10入10嗚。發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長:外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間碰撞引起的轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷。常發(fā)生在/或S.外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅” o系間跨越：激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā) 生變化的非輻射躍遷。禁阻躍遷，但當(dāng)能層有較大重

9、疊時就可發(fā)生系間 跨越，通過自旋一軌道耦合進(jìn)行。106s磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級-基態(tài)（巧 躍遷）；發(fā)光速度很慢：lOlOOsx磷光的能量比熒光小 電子由進(jìn)入巧的過程：（s0-r,禁阻躍遷）激發(fā)-振動弛豫-內(nèi)轉(zhuǎn)移-系間跨越-振動弛豫T 光照停止后，可持續(xù)一段時間2.熒光的激發(fā)光譜與熒光光譜excitation spectrum and fluorescence spectrum熒光分子都具有兩個特征光譜: 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（熒光光 譜）。（1）熒光的激發(fā)光譜激發(fā)光譜：表示不同激發(fā)波長 下所引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的 相對效率。繪制激發(fā)光譜:定發(fā)射波長（選最大發(fā)射波長），然

10、后以不同波長的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，以熒光強(qiáng)度F對萊的激發(fā)光譜（I）、熒光 （II）和磷光（111）光譜圖激發(fā)波長入作圖，即為激發(fā)光譜。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng) 度最大，稱為最大激發(fā)波長九級（2）熒光的發(fā)射光譜（熒光光譜）熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對強(qiáng) 度。繪制發(fā)射光譜時，使激發(fā)光波長固定在九、處，然后對發(fā) 射光譜掃描，測定各種波長下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度 F對發(fā)射波長九作圖，得發(fā)射光譜圖（即熒光光譜）。發(fā)射光譜（熒光光譜）的位置？磷光光譜的位置？激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a. Stokes位移熒光光譜總是位于物質(zhì)激發(fā)光譜的長波一側(cè)，即熒光波 長大于

11、激發(fā)光波長的現(xiàn)象。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值=振動弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換等物輻射躍遷損失了部分能量。b.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子可以躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量（如能級圖；12、兄I），產(chǎn)生不同吸收帶，但熒光光譜卻只有一個發(fā)射態(tài)，如;h。 為什么？距臨波長鏡像規(guī)則C.鏡像規(guī)則由于電子基態(tài)的振動能級分布與激發(fā)態(tài)相似，故通常 熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對稱關(guān)系。各小峰波長 遞減值與振 動能級差有 關(guān)，客小峰 的高度與躍 遷幾率有關(guān)?；鶓B(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動 能級分布類似；基態(tài)上的某振動能級若躍遷到第一激發(fā)態(tài)的某振動能 級的幾率較大的話，相反躍遷也如此。惹的乙酵

12、溶液的熒光光it （右）和吸收光譜（左）圖二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 relation between fluorescence and molecular structure1 分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu);（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（q）=發(fā)射的光量子數(shù)吸收的光量子數(shù)如果一個分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為100%。物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率范圍一般是多少?252 有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系(D躍遷類型：兀* T兀的熒光效率高，系間跨越過程的速率 常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；(2)共輒效應(yīng)：提高共覘度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移(3)剛性平面結(jié)構(gòu)：

13、可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光如熒光素和酚駄有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光, 酚駄卻沒有。*苯環(huán)取代英的熒光相對/度(乙醉洛液)(4)取代基效應(yīng)：芳環(huán)上 有供電子基，使熒光增強(qiáng)。化合物分子式熒比波長秸/nm熒光的相對愛度*270- 31010甲苯c6h,ch5270 320)7丙苯27032017代c已F270- 32010氯代苯CHC1275- 3457代萃C*H,Br2903805碘代苯C0J0C”O(jiān)H285 36518酚離子cji,o-310 40010苯甲C.HQCH)285 34520苯胺CJi5NH3310 40520苯胺離子c,h5nh;0甲腹CJi.CO

14、OH310 3903苯基C,H5CN280 36020硝*CHjNO.027三、影響熒光強(qiáng)度的因素relation between fluorescence and molecular structure影響熒光強(qiáng)度的外部因素1 溶劑的影響同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的形狀和強(qiáng)度都有差別。 一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強(qiáng)度也 有所增強(qiáng)。這是因?yàn)樵跇O性溶劑中，7TT於躍遷所需的能量差 E小，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均 長移，強(qiáng)度也增強(qiáng)。溶劑粘度減小時，可以增加分子間碰撞機(jī)會，使無輻射躍遷 增加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫 度

15、對溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此 溫度上升，熒光強(qiáng)度下降。2 溫度的影響熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，分子運(yùn)動速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在（TC以下，溫度每降低10°C, 0增加3%,在-809時，0f為1。3.溶液pH對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，溶液的pH值對該熒光物質(zhì)的 熒光強(qiáng)度有較大影響，這主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的 平衡改變，離子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此熒光強(qiáng)度也有差異。每一種熒 光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就是有它最

16、適宜的 pH值范圍。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡關(guān)系：pH<2pH7 12pH>13苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于-NH2為提高熒 光效率的取代基，故苯胺分子會發(fā)生藍(lán)色熒光。但在pHv2和pH> 13的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。4 內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā) 射的熒光，如色胺酸中的重鉛酸鉀；自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蔥化合物。蔥的乙醇溶液的熒光光譜佑）和吸收光譜（左）圖5 熒光熄滅劑熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互 作用引起熒

17、光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑(quenching medium)o如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、撥基和竣基化合物均為常見的熒光熄滅劑。6、散射光小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動方向發(fā)生 改變而向不同角度散射。瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只 是光子運(yùn)動方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把 部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而 發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須

18、采取措施消除。拉曼光的干擾主要來自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā) 光波長選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾320nm或350nm為激發(fā)光,熒光峰總是在448n m。將空白溶劑分別在320nm及 350nm激發(fā)光照射下測定熒 光，激發(fā)光波長為320nm時, 拉曼光波長是360nm, 360nm的拉曼光對熒光無影 響；當(dāng)激發(fā)光波長為350nm 時，拉曼光波長是400nm, 400nm的拉曼光對熒光有干 擾，因而影響測定結(jié)果。3434熒光試劑是一種可以使非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)與其反應(yīng)之后，得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物的標(biāo)記物，從而可擴(kuò)大熒光分析法的使用范1.有機(jī)化合物的

19、熒光分析脂肪族化合物能產(chǎn)生熒光的為數(shù)不多。芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共輒體系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能發(fā)射熒光。有時為了提高測定的靈敏度和選擇性,常使弱熒光性物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物（衍生化）。因此，熒光分析法在有機(jī)物測定方面的應(yīng)用很廣。34能用熒光分析法測定的有機(jī)物包括多環(huán)胺類、蔡酚類、 嗥咻類、口引喙類、多環(huán)芳桂類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨 基酸類及蛋白質(zhì)等；藥物中的生物堿類如麥角堿、蛇根堿、 麻黃堿、嗎啡、哇咻類及異哇咻類生物堿等；綃體類如皮質(zhì) 激素及雌醇等：抗生素類如青霉素、四環(huán)素等：維生素類如 維生素A、B、B2. B6. Bq E、抗壞血酸、葉

20、酸及煙酰胺等。 此外，中草藥中的許多有效成分，不少是屬于芳香性結(jié)構(gòu)的 大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析法作初步鑒別及含量測定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域進(jìn)行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個重要的熒光 試劑：1.熒光胺(fluorescamine):能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光。lOOmg熒光胺溶于100ml無水丙酮中，放置24小時后即可使用。取相當(dāng)于lOmg藥物的甲 水溶液0.1ml,加適宜pH值的磷酸緩沖溶液5ml,加熒光胺試劑O.Iml, 混合，放置15分鐘后測定熒光強(qiáng)度。熒光條

21、件為：z?ex=275.390nm, A cm=480nm。2.鄰苯二甲醛(OPA)在2-疏基乙醇存在下，pH910的緩沖溶液中OPA能 與伯胺類、特別是除半胱氨酸、脯氨酸及徑脯氨酸外的a-氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。取OPA500mg溶于10ml乙醇中，力口200ml 2-疏基乙醇，將此混合液加至1L 3%的硼酸溶液中，再用KOH調(diào)節(jié)至pH10,即為常用試劑溶液。熒 光條件為：2 ex=340nm, A em=455nm。31-二甲氨基-5-氯化礦酰(Dansyl-Cl,丹酰氯)能與伯胺、仲胺及酚基的生物堿類反應(yīng)生成熒光性產(chǎn)物。 取50mg或1 OOmg試劑，溶解于500ml無水丙酮中即可使用

22、。 與丹酰氯類似的一個試劑是丹酰B(Dansyl-NHNH2),它能 與可的松的按基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件為： A ex=365nm, A em=500nm左右。丹酰氯試劑不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物Dansyl-OH呈藍(lán)色熒光 ,必須暗處保存，每周重新配制。«XftW機(jī)化合檢的英光測定法試M澈發(fā)光波長 nm熒光浚長測定耙HH c/(pg cm'3)nm丙三醉苯JR衆(zhòng)外xe0.1 29隆MM4655051.5-15M3654000-5睪基水楊駛flfcN,Nr- 一甲星甲験胺(KOH)3664103 x 1(T$ 5 x 10"4 mol dm 宀0.1 mol dm&

23、quot;1 NaOH紫外500紫外(365)485IO"10堆生余A無水乙IB3454900-20氨棊酸氣化等3154250.01 50盍白質(zhì)睛紅丫薰外5400.06-6腎上蘇囊乙二疲4205250.001 0.02MMTK鄰華二IK3654700.05-5茨璃酸IW3乙酰氛基吋嗓3954700.001 0.033甘甲MM-6-M-9-(e-氮乙«)«基氮雜滋4205000.0625 0.625F111-*i40«XftW機(jī)化合檢的英光測定法#«XftW機(jī)化合檢的英光測定法2 無機(jī)化合物的分析無機(jī)離子一般不顯熒光，與有機(jī)試劑形成有熒光的配 合

24、物后，可測量約60種元素及離子披、鋁、硼、掾、硒、鎂、稀土采用熒光分析法#«XftW機(jī)化合檢的英光測定法氟、硫、鐵、銀、鉆、臻采用熒光熄滅法測定銅、鐵、鉆、餓及過氧化氫采用催化熒光法測定 輅、錠、鈾、確一采用低溫?zé)晒夥y定篩、鑄、鎂、仏鈾采用固體熒光法測定#第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限, 且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光, 所以熒光法很少用來定性分析當(dāng)一束強(qiáng)度為 的紫外/可見光照射一濃度為、液層厚 度為的液槽時，可在溶液的各個方向觀察到熒光，其吸收光強(qiáng)度為人透過光強(qiáng)度為厶 熒光強(qiáng)度為垂直方向41熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度人(=/0./t)F = (70-Zt)取決于熒光效率處根據(jù)Beer Law 卡=10_fcZF = K'Qo-/oXlO"Z)= /C7o(l-lOz)= K7o(l-e 一 2303G)由于 ex =l+x+x2/2!+x3/3!+.+x"/n!所以 &23G=i 2.36T/+ (-2.3£cl) 2/2!+ (-2.3£r/)