蛋白質(zhì)分子定向進化其他方法

1、蛋白質(zhì)分子定向進化其他方法自然界在長期的進化過程中.產(chǎn)生了許多具有重要功能的符合人們需要 的理想蛋白質(zhì)，然而，當(dāng)它們處于復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)體系時，貝y往往不能滿足 人們的需要。為此，必須不斷推出新的方法來改造現(xiàn)有的蛋白質(zhì)，以滿足工 業(yè)的需要。自然進化是有機體在長期的進化過程中自發(fā)出現(xiàn)的非常緩慢的過 程。自然選擇往往是朝著有利于機體的方向進行的。大量定點基因突變實驗表明，蛋白質(zhì)功能和性質(zhì)的改變來自于許多小的內(nèi)部修飾的積累，這些小的 修飾或突變分布于較大的序列空間內(nèi)，人們試圖利用已有的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息對蛋白質(zhì)進行合理設(shè)計(rati onal design),但蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性極大地增 加了合理設(shè)計的難

2、度，更何況，對于大多數(shù)要改造的蛋白質(zhì)來說，我們并不 清楚其三維結(jié)構(gòu)信息，不能進行合理設(shè)計，而近年來發(fā)展的分子定向進化(molecular directed evolution)策略屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計范疇，它不需 要事先了解蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息和作用機制，而是在體外模擬自然進化的過程(隨機突變、重組和選擇)，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需 性質(zhì)或功能，從而在幾天或幾周內(nèi)實現(xiàn)自然界需數(shù)百萬年才能完成的事情。定向進化第一步是由一個靶基因或一群相關(guān)的家族基因起始創(chuàng)建分子 多樣性(突變和/或重組)；然后對該多樣性文庫的基因產(chǎn)物進行篩選，那 些編碼改進功能產(chǎn)物的基因被利用來繼續(xù)下一輪進化；重復(fù)這

3、個過程直到達 到目標(biāo)。該進化策略有以下三個顯著特征：a.進化的每一關(guān)鍵步驟都受到嚴(yán)密控制；b.除修飾改善蛋白質(zhì)已有特性和功能外，還可引入一個全新的功能，來執(zhí)行從不被生物體所要求的反應(yīng)；甚至為生物體策劃一個新的代謝途徑； c.能從進化結(jié)果中探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本特征。蛋白質(zhì)定向進化通常分三步進行：基因隨機誘變、體外重組和篩選。每 一步都可以有多種方法。常見的定向進化方法有：易錯PCR技術(shù)DNA改組技術(shù)外顯子改組 交錯延伸重組隨機引物體外重組法(RPR)。當(dāng)然還有其他的方法，下 面就來給大家一一介紹。一、隨機誘變化學(xué)誘變劑介導(dǎo)的隨機誘變體外隨機誘變也可在65C下直接用羥胺處理帶有目的基因片段的

4、質(zhì)粒， 然后用限制性內(nèi)切酶切下突變了的基因片段，再克隆到表達載體中進行功能的篩選。由致突變菌株(mutator strain)產(chǎn)生隨機突變美國stratagene公司構(gòu)建了一株DNAI復(fù)途徑缺陷的大腸桿菌突變株 XLI-Red，它體內(nèi)的DN庚變率比野生型高五千倍。將帶有要突變基因的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到XLl-Red菌株內(nèi)復(fù)制過夜，在此過程中會產(chǎn)生隨機突變。每兩千個堿 基中通常約有一個堿基置換。將帶有突變過的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達系統(tǒng)中 進行篩選。連續(xù)幾代的隨機突變和篩選的方法是從每一代中挑選出一個最佳的突 變體作為下一代的親本。通過積累氨基酸的正突變，可加快進化的進程。定點突變和定點飽和突變技術(shù)定點突變

5、技術(shù)(Site directed mutagenesis)般用于對DN分子特定位點的突變，所以需要預(yù)先知道野生型基因序列。 早在1978年Michael Smith 就運用寡核苷酸進行定點突變。定點突變的基本原理是首先合成一段含有突 變堿基的DNAI物，然后這段合成的引物可以雜交到包含有目的基因的單鏈DN上，用DNA聚合酶將剩余片段進行延伸，得到的雙鏈分子轉(zhuǎn)入到宿主細胞 并被克隆，最后用特定的篩選方法將突變子篩選出來。定點突變技術(shù)有盒式 誘變和多種基于PCR勺突變方法，最常見的有重疊PC等方法。當(dāng)靶位點氨基 酸分別可被其它19種氨基酸代替而得到突變子的方法，稱為定點飽和突變技 術(shù)，此方法是要著

6、重尋求靶位點的最適氨基酸。定點突變和定點飽和突變技 術(shù)的運用，能極大地豐富突變體庫的多樣性。組合活性中心飽和突變試驗組合活性中心飽和試驗(combinatorial active .site saturation test ,CAST的基本原理是：在酶的活性中心部位尋找一系列在空間位置上相互接 近的氨基酸對作為突變位點，選擇的氨基酸對必須是在側(cè)鏈基團取向上具有 潛在的協(xié)同作用。因此，突變后才可能獲得更具有潛力的突變體。這是單點 突變不能做到的。如果選擇的氨基酸對應(yīng)的位置是 n,貝卩第2個氨基酸的選擇 遵循以下的原則：如果第n個氨基酸在環(huán)上，則另一個氨基酸選擇第 n+1位； 若在B折疊上則選擇第

7、n+2位，若在310螺旋上，則選擇第n+3位；若在a螺旋 上，則選擇第n+4位。對于CAS突變體庫容量的計算：每突變一對氨基酸要 進行飽和隨機突變，即這一對氨基酸要突變成 20種氨基酸的任何一種。以2NNK(代表任何一種核苷酸，K代表是G或 T)作為突變的堿基形式，則有32=1 024種不同的組合，而氨基酸則可突變成 202=400種不同的組合。因此，要將 每個庫的所有突變的覆蓋率達到95%，則每個庫至少要挑3000個克隆子。此外，近年來還發(fā)展出了更多的、新穎的無性突變技術(shù)。例如，三核苷 酸突變(TriNex)，隨機插入-刪除突變(RID)，序列飽和突變(SeSaM)以及它 的改進方法SeSa

8、Tv+。這些方法都是為了能最大程度的增強突變體庫的多 樣性，豐富并延伸無性突變的方法手段。二、基因體外重組限制性酶切-再連接介導(dǎo)的基因重組(recombining the genes by restrictio n and religatio n)利用限制性內(nèi)切酶對欲重組的兩個以上 DN序列進行酶切，然后在連接 酶的作用下隨機重新連接起來，可實現(xiàn) DN分子問的重組。實驗證明，簡單 的酶切-再連接可進一步提高對硝基苯酯酶的活性。但如果兩個正突變處于 同一段限制性酶切片段上，貝S無法將它們重組于同一序列中?；蚣易甯慕M在基因改組的基礎(chǔ)上，1998年由Crameri等提出了基因家族改組技術(shù) (DNA

9、 family shuffli ng)，至此才是真正的有性重組的開始。基因家族改組 與單基因改組最大的區(qū)別在于出發(fā)序列的同源性。利用基因家族同源序列進 行DNA改組，實現(xiàn)同源重組。由于同源序列是經(jīng)過自然選擇保留下來的相對 有益或無害的片段，所以基因家族改組的突變機率和改組效率明顯提高，體 現(xiàn)了基因的多樣性。過渡模板隨機嵌合生長過渡模板隨機嵌合生長(random chimeragenesis on transient templatesRACHITT )技術(shù)是與DNA shuffling概念上明顯不同的、改進的基因家族重 組技術(shù)。它不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯延伸反應(yīng)，而是將隨機切割的基因 片段雜

10、交到一個臨時DNA模板上進行排序、修剪、空隙填補和連接(圖2) 其中的懸垂切割步驟使短片段(比 DNase消化片段還短)得以重組，明顯提 高了重組頻率；如果在片段重組前后采用錯誤傾向PCR還可引入額外點突變。CoCo等首次報道此法改造二苯并噻吩單加氧酶，產(chǎn)生的嵌合文庫平均 每個基因含14個交叉，重組水平比DNA shuffling類方法(14個交叉)高出幾倍；并且可在短至5bp的序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生交叉。這種高頻率、高密度的交叉水平是DNA shuffling所難以達到的。會尿略摩的另一親本基禺的 尸桂低為釉時耳丁礙橫脈I娶剪曇垂呼列、單補空、連接J統(tǒng)劇.模梅睜列引人F代厳和體碎去昨架輕板齪制51

11、橇菟履和歸粧Fig. 2 Tht general procedure of RACHTn9-1圖2 RACHITTS基本程序®酵母增強組合文庫酵母增強組合文庫(comb in atorial libraries enhan ced byrecomb in ati on in yeast, CLER Y)是一個真核基因家族 shuffli ng 策略。其 原理是將體外DNA shuffling程序與接下來的酵母體內(nèi)重組締合起來，構(gòu)建高 豐度低親本水平的重組文庫：直接以含目的基因的質(zhì)粒作為體外shuffli ng的模板；shuffling后基因產(chǎn)物與線性化的酵母表達載體共轉(zhuǎn)化酵母細胞啟動

12、體 內(nèi)重組事件，同時表達功能性重組子直接用于篩選。Trua n等用該法重組人細胞色素P450 1A1和1A2，所得文庫含86%的嵌合基因，大大提高了文庫豐 度；另外，用單鏈DNA做shuffling的模板可進一步降低文庫中的親本比率。 該法為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能研究、多組分真核復(fù)合酶活力的調(diào)控提供了一個新 的有力工具。漸增切割法產(chǎn)生雜和酶盡管DNA shuffling介導(dǎo)的重組已成為定向進化創(chuàng)建高質(zhì)量序列多樣性 的重要工具，但它們通常不能用于重組同源性低于70%80%的序列。而自然 界大多數(shù)同源序列具有比這個數(shù)目低得多的相似性。為了解決這個問題，Ben kovic研究組建立了漸增切割法產(chǎn)生雜和酶（

13、in creme ntal trun cation for the creation of hybrid enzymes ITCHY ）及Thio-ITCHY （ a -硫代磷酸核苷酸介 導(dǎo)的ITCHY ）方法來產(chǎn)生不依賴于DNA序列同源性的重組文庫。ITCHY的基 本原理是：控制核酸外切酶#的切割速度不大于10堿基/ min ,然后間隔很短 時間連續(xù)取樣終止反應(yīng)，以獲得一組依次有一個堿基缺失的片段庫；然后將 基因A的一組隨機長度的5端片段與基因B的一組隨機長度的3端片段隨機 融合產(chǎn)生雜合基因文庫。但由于該方案冗長繁瑣，Lutz等又提出了Thio-ITCHY方法：首先將待PCf反應(yīng)或單鏈模板引

14、伸反應(yīng)將a -硫代磷酸核苷 酸隨機引入產(chǎn)物中，由于其抗核酸外切酶皿的切割，接下來的切割反應(yīng)會在 此處隨機終止，連接切割產(chǎn)物即產(chǎn)生隨機交叉文庫該法操作便利，同時也可 引入隨機點突變。此外，ITCHY/Thio-ITCHY不依賴DNA序列同源性，可在 非序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生活性融合子。迭代ITCHY或?qū)ζ湮膸爝M行shuffling還可 以創(chuàng)造多個交叉。不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組盡管上述ITCHY可以進行不依賴于序列同源性的重組，但它是一個隨機長度片段與另一個隨機長度片段相融合，結(jié)果文庫中基因長度不再保守，子 代中功能雜合子的比率很低。要想提高功能雜合子所占比例，須使交叉發(fā)生 在具有相似結(jié)構(gòu)環(huán)境的位置

15、，但由于缺乏足夠的序列相似性，同源重組不能 發(fā)揮作用，因此Sieber等提出了不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組（sequeneehomology-i ndepe ndent protein recomb in ati on, SHIPREC )方法：通過瓊脂 糖凝膠電泳回收單基因長度隨機片段，保證了子代嵌合體長度的保守性，使 交叉保持了適當(dāng)?shù)男蛄衅ヅ?，主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的位點，交叉點處的兩 個氨基酸仍處于它們在親本蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的位置，從而提高了文庫中陽性克隆的比例。該法可以在低序列同一性甚至無序列同一性的同源蛋白質(zhì)間創(chuàng)造 具有單交叉的雜合蛋白質(zhì)組合文庫。迭代 SHIPREC可以產(chǎn)生多個交叉。隨著

16、酶分子定向進化的發(fā)展，在常規(guī)的定向進化方法的基礎(chǔ)上，又相繼 開發(fā)出另一些新方法，如設(shè)計的寡核苷酸裝配 (assembly of desig ned olig onu cleotides , ADO)誘變和單向重組 (mutage nic and uni directi onal reassembly，MURA)隨機插入-刪除鏈交換突變(random insertional deletional strand exchange mutagenesis，RAISE)、基于 Y連接的構(gòu)件改組(Y-ligation-based block shuffling，YLBS)合成改組(syntheticsh

17、uffli ng)等新方法都有改造蛋白的成功案例，也為更好的進行定向進化提供了強有力的工具和指導(dǎo)思想。三、文庫篩選策略一旦多樣性文庫構(gòu)建好后，定向進化實驗成敗與否的關(guān)鍵則在于“要有 針對目的改造特征的高效篩選方案”。近幾年，與創(chuàng)建多樣性重組文庫的發(fā) 展相適應(yīng)，在高流通量和超高流通量篩選技術(shù)方面也取得另人矚目的成就。 其中核糖體展示技術(shù)與mRNA展示技術(shù)，由于在體外無細胞翻譯體系中進 行，不受細胞轉(zhuǎn)化效率的限制，大大提高了文庫容量和篩選通量(10121014)。 它們的原理是通過篩選靶蛋白-核糖體-mRNA三元復(fù)合物或靶蛋白-mRNA二 元復(fù)合物，將基因型與表型直接偶聯(lián)起來，并利用mRNA的可復(fù)

18、制性，使靶基因(蛋白)得到有效富集。利用此法進化單鏈抗體可變區(qū)scFv片段，獲得親和力提高40倍的變異株其他高通量篩選方法，如細胞表面展示技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)；將 靶活力與轉(zhuǎn)錄信號相偶聯(lián)的三雜交體系；以發(fā)光信號為指示的反射增進系 統(tǒng)；利用熒光信號的熒光共振能量轉(zhuǎn)換儀（FRET，結(jié)合熒光激活細胞篩選 儀（FACS），每小時可篩選60000個細胞。最近Chadessy等還報道了一種隔 室化自復(fù)制技術(shù)，通過一個只復(fù)制其自身基因的聚合酶組成的簡單反饋環(huán)將 體外進化與篩選有機結(jié)合起來，使陽性克隆得到快速、高效的富集，獲得熱 穩(wěn)定性提高11倍，肝素抗性提高130多倍的Taq DNA聚合酶突變株。在硬件

19、設(shè)備方面，1536和3456孔板以及多通道多波長檢測儀的出現(xiàn)、 每秒鐘分配幾千滴皮升級樣品的非接觸式壓電配樣儀的問世等都大大提高 了樣品處理速度。定向進化的意義定向進化不僅在工業(yè)、醫(yī)療方面對蛋白質(zhì)的改造具有重要的意義，而 且，它也非常適合于基礎(chǔ)理論的研究。對蛋白質(zhì)分子進化得到的突變體進行 分析，為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系提供了新的工具。天然蛋白質(zhì)序列 中往往有很多是隨機遺傳漂移，而不是功能性的適應(yīng)。例如，從適應(yīng)不同環(huán) 境的物種中提取出的蛋白質(zhì)經(jīng)常有幾十個氨基酸的不同，其中只有一小部分是與特定功能差異有關(guān)的。大量的中性突變只能干擾科學(xué)家辨別分子的規(guī) 律。在實驗室的進化實驗中，種系很清楚，而且

20、突變主要是適應(yīng)性的。Amold 等人使用高保真DN改組成功地區(qū)分出基因中的功能性和非功能性突變。通 過定向進化來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，可為蛋白質(zhì)的理性設(shè)計提供理論依據(jù)。參考文獻1. Zhao Huimin;Arnold Frances H查看詳情外文期刊19972. Zhao Huimin;Arnold Frances H查看詳情外文期刊1997(94)3. Gree ner A;Callaha n. M Perform Ran dom Mutage nesis 19944.Seiichi Taguchi;Akiyoshi Ozaki;Haruo Momose查看詳情外文期刊1998(

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