分子生物學(xué)在獲取中藥有效成分方面的研究與應(yīng)用

1、分子生物學(xué)在獲取中藥有效成分方面的研究與應(yīng)用摘要：中藥有效成分的提取是中藥研究的一個(gè)重要任務(wù)， 一種藥材經(jīng)過復(fù)雜的分離提取后獲得的有效成分往往十分微量。如何獲得更多的有效成分是中藥研究的重要內(nèi)容。分子生物學(xué)技術(shù)能為此研究提供新的方法，研究人員通過尋找中藥有效成分的相關(guān)功能基因，并通過基因工程的方法對其進(jìn)行高效表達(dá)，大大提高了中藥有效成分的得率，并降低了提取成本。 關(guān)鍵字：分子生物學(xué) 有效成分 中藥 石斛當(dāng)今，以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，以基因工程為主導(dǎo)的生物技術(shù)正以其巨大的活力推動(dòng)著生命各學(xué)科的發(fā)展。進(jìn)入21世紀(jì)，這一高新技術(shù)，在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中亦開始陸續(xù)被推廣應(yīng)甩。綜合近幾年國內(nèi)外的研究 成果，

2、主要有以下幾個(gè)方面：1 分子生物學(xué)與中藥鑒定 中藥的傳統(tǒng)鑒定方法主要依靠基源鑒定、 性狀鑒定、 顯微鑒定以及理化鑒定四大類方法。單純依賴于以上傳統(tǒng)的鑒定方法，已經(jīng)不能有效防止中藥的混淆代用和故意偽制的發(fā)生。基于 DNA分析的分子鑒定技術(shù)，具有特異性高、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，已成為傳統(tǒng)鑒定方法的重要補(bǔ)充手段為中藥品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范管理的國際化開創(chuàng)良好開端。 2 分子生物學(xué)與中藥資源保護(hù) 傳統(tǒng)的藥用植物資源研究，主要采用形態(tài)分類學(xué)方法劃分物種。由于此方法僅建立在個(gè)體形狀描述和宏觀觀測的水平上，得到的結(jié)論并不完善。通過引入分子生物學(xué)方法， 分析藥用植物的遺傳特性以及建立遺傳圖譜，使植物分類和資源的研究

3、更加科學(xué)化1。肉蓯蓉屬名貴中藥材，主要來源植物為荒漠肉蓯蓉和管花肉蓯蓉，目前野生肉蓯蓉資源已僅剩幾 個(gè)主產(chǎn)區(qū)。 通過提取樣本DNA，運(yùn) 用 RAPD技術(shù)對荒漠肉蓯蓉野生居群和管花肉蓯蓉 野生居群進(jìn)行研究，利用POPGENE32版軟件分析其群體的遺傳多樣性。結(jié)果顯示，兩種肉蓯蓉的遺傳多樣性均呈低下，不利于其適應(yīng)環(huán)境變化的能力。 通過分析肉蓯蓉遺傳多樣性的差異，為如何保護(hù)肉 蓯蓉提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)遺傳學(xué)依據(jù)2。3 分子生物學(xué)與中藥的機(jī)理研究中藥的機(jī)理研究通過應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)已深入到幾乎是最根本的基因轉(zhuǎn)錄水平， 并在該水平上對中藥的療效獲得了一定解釋，但整體上還處于探索階段。已有的研究主要是應(yīng)用如核

4、酸分子雜交、RT -PCR技術(shù)等考察“單基因” 的技術(shù)，應(yīng)用如DD -PCR、DNA陣列等研究多基因的技術(shù)的報(bào)道較少。 中藥調(diào)節(jié)機(jī)體平衡的特點(diǎn)決定了對基因轉(zhuǎn)錄的影響很可能是對多基因的協(xié)同影響， 如對補(bǔ)腎生血方的系列研究已表明此方的功效與影響EPOR、 SCF、c-myc、Bcl- 2、GM-CSF基因表達(dá)有關(guān)。因此，應(yīng)用研究多基因表達(dá)的技術(shù)考察對多基因的協(xié)同影響將是未來中藥基因轉(zhuǎn)錄水平作用機(jī)理研究的主要方向。相信隨著現(xiàn)有技術(shù)的不斷發(fā)展和完善、新技術(shù)的出現(xiàn)及多種技術(shù)相結(jié)合加上疾病細(xì)胞分子水平研究的深入，復(fù)雜的中藥作用機(jī)理會(huì)逐步得到闡釋，中藥的療效和可能發(fā)現(xiàn)的新功效將從機(jī)理上獲得科學(xué)依據(jù)，為中藥獲

5、得像西藥一樣的市場準(zhǔn)人權(quán)提供有力的支撐3。： 雖然隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，中藥材的提取方法得到了飛速發(fā)展，一些新的提取方法如超聲提取技術(shù)、超臨界流體提取技術(shù)、微波輔助提取技術(shù)、半仿生提取技術(shù)等得到一定的應(yīng)用，但各種方法不但有自身存在的缺點(diǎn)，更重要的是它們不能從根本上增加藥材有效成分的含量。因此，在一味的追求更好的提取方法的同時(shí)，也應(yīng)該在提高藥材自身成分含量上作出相應(yīng)的研究4。本文以下主要介紹該方法的研究與應(yīng)用概況。該方法目前主要是利用理化因子定向誘導(dǎo)藥材某個(gè)藥用部位，如根莖、種子等， 獲得穩(wěn)定的藥材藥用部位突變體， 并運(yùn)用cDNA -AFL技術(shù)對突變體表達(dá)進(jìn)行分析；以Mrna - cDNA克隆法，

6、單克隆抗體等構(gòu)建以獲得差異表達(dá) mRNA反義基因； 構(gòu)建相應(yīng)的載體，轉(zhuǎn)化藥材，分析轉(zhuǎn)基因石斛中的成分石斛堿的變化 ， 對反義基因進(jìn)行篩選，確定石斛堿功能基因； 并進(jìn)行基因的全長克隆， 從而獲得藥材有效成分相關(guān)功能基因， 再進(jìn)一步對運(yùn)用基因工程方法對藥材有效成分進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。 單克隆抗體是由單個(gè)細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)增殖而形成的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的完全均一的、單一特異性的抗體。因此，制作出針對中藥不同成份的單克隆抗體，然后用來鑒定中藥的成份或測定其含量的多少。是一種簡便而又高靈敏度的、重復(fù)性好的測定方法。而且，單克隆抗體不僅可以作為測定試劑還可以制成親和層析柱，迅速地、高特異性地從復(fù)合物中提取

7、出相應(yīng)的有效成份5。 石斛為傳統(tǒng)名貴中藥材，為蘭科(Orchidaceae)石斛屬( Dend obium Sw)， 以新鮮或干燥的莖人藥 ， 我國76種石斛屬植物中有30多種作為藥用，著名的有鐵皮石斛、金釵石 斛、霍山石斛等， 其具有“ 滋陰養(yǎng)胃、清熱生津、潤肺止咳、明目強(qiáng)身”之功效，神農(nóng)本草經(jīng)將其列為上品，被譽(yù)為“ 中華九仙草”之首。藥用石斛的有效成分主要是生物堿和多糖。現(xiàn)代藥理研究表明， 石斛還具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、擴(kuò)張血管及抗血小板凝集、有效減輕肝損傷等作用，對眼科疾病也有明顯的治療作用。但由于石斛對環(huán)境的要求十分嚴(yán)格，自然條件下 ，種子萌發(fā)率極低，生長極緩慢， 再加上過

8、度采挖及環(huán)境的惡化，藥材資源日趨枯竭。為保護(hù)利用這一珍稀中藥材， 增加產(chǎn)量，不少學(xué)者進(jìn)行了石斛組織培養(yǎng)快速繁殖研究， 并取得了一定的進(jìn)展 。但試管苗移栽成活率低， 產(chǎn)量低， 目前還沒能應(yīng)用試管苗進(jìn)行大面積栽培，不能滿足藥材市場的需求。因此石斛藥源一直處于相當(dāng) 緊張狀態(tài)， 亟待解決6,7. 應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)來解決才是長遠(yuǎn)之計(jì)，本文以藥用石斛的分子生物學(xué)在提高其有效成分石斛堿這一方面作一介紹。 石斛堿為石斛主要藥用有效成分之一 ，目前已能進(jìn)行人工合成， 但人工合成成本很高。因此石斛堿相關(guān)功能基因的獲得，為下一步通過基因工程大量生產(chǎn)石斛堿奠定基礎(chǔ)。研究人員利用理化因子定向誘導(dǎo)鐵皮石斛種

9、胚原球莖已經(jīng)獲得穩(wěn)定的石斛堿缺失的突變體；運(yùn)用 cDNAAFLP技術(shù)、用差異顯示對突變體表達(dá)進(jìn)行分析；以 mRNAcD A克隆法構(gòu)建鐵皮石斛差減cDNA文庫；以獲得的差異表達(dá)的mRNA的反義基因構(gòu)建相應(yīng)的載體， 轉(zhuǎn)化石斛，分析轉(zhuǎn)基因石斛的成分石斛堿的變化，對反義基因進(jìn)行篩選 ，確定石斛堿功能基因； 并進(jìn)行基閃的全長克隆，從而獲得石斛堿相關(guān)功能基因這些都為有效利用、開發(fā)、保護(hù)及開拓石斛資源創(chuàng)造條件。 Yang H H等從石斛中分離出了色素合成基因，并得到了高效表達(dá)。Kuehnle H 等用帶有植物表現(xiàn)NosNPrr基因和番木瓜病毒(PRV)膜蛋白(CP)基因的質(zhì)粒 pGA482 G G cpP

10、RV4包被的微粒轟擊石斛的原球莖進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。通過4次雜交得到的近2 8 0個(gè)原球莖被粒子轟擊，轉(zhuǎn)化與否表現(xiàn)在組織是否變綠。培養(yǎng)基為 12 MS+2 蔗糖 +( 5 0 01 0 0 )mg L硫酸卡那霉素。PCR分析表明，由2次雜交得到了13株具有卡那霉素耐受性植株帶有 Nos NPrr 基因，而只有1株帶有 PRVCP基因。這些結(jié)論表明用粒子轟擊的方法可以實(shí)現(xiàn)單子葉植物石斛的轉(zhuǎn)基因。此外，石斛屬植物轉(zhuǎn)基因組織和植物的篩選還可用熒光素酶基因做為標(biāo)記。Chia等 用帶有 35Sluc嵌合基因質(zhì)粒包被的鎢顆粒u m) 轟擊石斛的原球莖，3周后，向轉(zhuǎn)化組織中 加入 1 mmoL的熒光素，轉(zhuǎn)化細(xì)

11、胞可通過低光視頻顯微鏡及其輔助圖像處理設(shè)備檢測生物性發(fā)光辨別。將轉(zhuǎn)化的組織切割下來培養(yǎng)生長，然后進(jìn)行第2輪篩選。這樣經(jīng)過 3輪的生長和篩選后，表達(dá)熒光素酶的組織表明基因在該組織中轉(zhuǎn)化成功。同時(shí)Southern雜交也證明熒光素酶基因已結(jié)到植物基因組，該方法也可用于其他植物基 因轉(zhuǎn)化的檢測。除了用粒子轟擊的方法來進(jìn)行石斛原球莖轉(zhuǎn)基因的研究外，有關(guān)石斛的研究還涉及了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因。利用根癌農(nóng)桿菌 Agrobacterium rhizogenes 侵染宿主植物受傷部位的細(xì)胞并產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化毛狀根，與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，轉(zhuǎn)化毛狀根具有生長迅速、傳性狀穩(wěn)定及激素自養(yǎng)型等特點(diǎn)，克服了植物細(xì)胞培養(yǎng)中對原

12、植物激素的依賴性，是生產(chǎn)次塵代謝產(chǎn)物較理想的組織。農(nóng)桿菌侵染植物的關(guān)鍵之一是細(xì)菌侵入性基 因誘導(dǎo)物的作用 ，誘導(dǎo)物在轉(zhuǎn)化過程中可將 T DNA的加下和轉(zhuǎn)運(yùn)通道激活，誘導(dǎo)Vir區(qū)基因的活化表達(dá)。在雙子葉植物中，許多天然酚性化合物如乙酰丁香酮、 香豆醇和芥子醇等都是已知的細(xì)菌侵入性基因的誘導(dǎo)物。但在石斛中，還沒有發(fā)現(xiàn)這類誘導(dǎo)物質(zhì)。Nan研究發(fā)現(xiàn)石斛組織培養(yǎng)中原球莖發(fā)育早期有大量的松柏醇產(chǎn)生，可誘導(dǎo)毒性基因的表達(dá)。如果將在暗處培養(yǎng)的原球莖轉(zhuǎn)入光照條件下，其含量呈6倍增加。原球莖松柏醇的產(chǎn)量是葉的11倍，這使通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因植物，即將克隆的花色基因、主要藥用成分表達(dá)基因等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入

13、石斛原球莖成為可能。但是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因在石斛中并未取得成功，這個(gè)研究結(jié)果提示農(nóng)桿菌對單子葉植物石斛的不敏感性可能存在著新的機(jī)制。以上主要是以利用分子生物學(xué)中常用的粒子轟擊和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的技術(shù)與原理使石斛中控制石斛堿的基因得到高效表達(dá)，從而達(dá)到提高石斛中有效成分石斛堿含量的目的。分子生物學(xué)在基因水平下來提高藥材的有效化學(xué)成分是獲得優(yōu)質(zhì)藥材的有效途徑，隨著技術(shù)的不斷更新與進(jìn)步，相信此方法在不久的將來將會(huì)得到廣泛的利用。參考文獻(xiàn)1.陳士林，蘇鋼強(qiáng)等中國中藥資源可持續(xù)發(fā)展體系構(gòu)建J中國中藥雜志，30(15)：1141.2.崔光紅，陳敏，黃璐琦等藥用肉蓯蓉的遺傳多樣性RAPD分析J中國中藥雜志，200

14、4，29(8):72.3.范秀娟,郭姣，楊國柱，羅朵生. 分子生物學(xué)技術(shù)在中藥作用機(jī)理研究中的應(yīng)用J廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2007.23(5):592-595.4. 莫雪梅. 分子生物學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀探討J. 現(xiàn)代食品與藥品雜志.2006.16(2):75-77.5.李杰芬.分子生物學(xué)技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用J.廣州中藥藥大學(xué)學(xué)報(bào)。1996.13（3、4）：97-99。6.張治國,劉驊,王黎等鐵皮石斛原球莖增殖的培養(yǎng)條件研究J.中草藥，1992，23(8)：431.7.郭順星,曹文芩,張集慧等.鐵皮石斛人種子制作流程及發(fā)芽研究J中草藥，1996 27(2)：105.8. 王金發(fā). 細(xì)胞生物學(xué).

15、北京：科學(xué)出版社，20039. 沈大棱,吳超群. Cell Biology （細(xì)胞生物學(xué)）. 上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，200610. 桂建芳，易梅生. 發(fā)育生物學(xué). 北京：科學(xué)出版社，200211. 特懷曼（R.M.Twyman）著. 王英典等譯. 發(fā)育生物學(xué). 北京：科學(xué)出版社，200612. 蔣曉林 ,劉昭陽;中醫(yī)氣學(xué)理論與現(xiàn)代分子生物學(xué)J;湖南中醫(yī)雜志;2002年06期13. 雷燕;淺談分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用J;北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);1998年06期14. 王米渠,吳斌,嚴(yán)石林,李煒弘,高泓;從分子生物學(xué)的角度探討中醫(yī)藏象學(xué)說的內(nèi)涵J;廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2002年04期15

16、. 王建云,付文,范亞剛;細(xì)胞與分子遺傳學(xué)技術(shù)鑒定藥材簡介J;中國藥事;1998年06期16. 陳蘇紅,王小紅,王升啟;中藥影響細(xì)胞基因表達(dá)的研究進(jìn)展J;中國中藥雜志;2000年09期17. 周海鈞;21世紀(jì)新藥研究與開發(fā)的展望J;中國新藥雜志;2000年01期18.Yang HH，Chua NHIsolation and characterization of genes involved in the pigment biosynthesis of orchids C Proceedings of 13 World Orchid Conference，199048-5019.Kuehnle AR，Cheng S，Zhang G,et al， Transformation of Dendrobium or chid using particle bombardment of protocormsJPlant Cell Repots，1992，11(9)：484-499.20.Chia TF，Giford DJ，Gou XP，et a1The firefly lucifera