β葡聚糖對巨噬細胞增殖胞內游離鈣及cAMP濃度的影響

1、葡聚糖對巨噬細胞增殖 胞內游離鈣及cAMP濃度的影響(1)    【摘要】  探討葡聚糖對RAW264.7細胞增生、胞內游離鈣及cAMP濃度的影響。方法： 中性紅比色法檢測細胞生長, 酚試劑法檢測細胞蛋白質合成, 動態(tài)檢測葡聚糖對胞內游離鈣和cAMP濃度的影響。結果： 微量葡聚糖可促進細胞生長及蛋白質合成;葡聚糖作用后35 min使胞內游離鈣濃度升高,作用1 min 后使cAMP濃度升高, 并保持較高水平。結論： 胞內游離鈣及cAMP是葡聚糖對RAW264.7細胞作用過程中重要的信使分子。 【關鍵詞】  葡聚糖 胞內游離鈣 環(huán)磷酸腺苷

2、 RAW264.7細胞系 增殖    Abstract  Objective: To explore the effect of glucan on proliferation, intracellular calcium and cAMP levels of RAW264.7 macrophage cell line.Methods： Cell growth and proliferation were detected by neutral red colorimetric assay, protein synthesis by Lowrys tes

3、t, and the concentration of cytosolic calcium and cAMP were determined continuously. Results： Cell growth and protein synthesis were enhanced by glucan; the concentration of cytosolic calcium was elevated 35 min after treatment with glucan cAMP level increased 1 min after the treatment and maintaine

4、d at high level. Conclusion： Cytosolic calcium and cAMP were important signal molecules in evaluating effect of glucan on RAW264.7 cell line.    Key words  glucan;  intracellular calcium;  cAMP; RAW264.7 cell line;  proliferation    隨著免疫抑制劑、激素、廣譜抗生素的

5、大量應用,器官移植技術的廣泛開展、各種導管的廣泛應用及腫瘤治療的廣泛應用,真菌感染尤其深部真菌性醫(yī)院感染日益增多。 葡聚糖是真菌細胞壁含量最高的多糖。本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為觀察對象，觀察不同濃度及不同時間的葡聚糖對RAW264.7細胞的直接影響, 特別是對細胞內第二信使傳遞的影響, 以探討葡聚糖對RAW264.7細胞的作用機制。    1  材料與方法    1.1  試  劑    RPMI1640、胎牛血清購自Gibco公司；Fura2 AM 購自中國科學

6、院藥物所；葡聚糖和EGTA購自Sigma公司；其余試劑均為進口分裝或國產分析純。    1.2  細胞培養(yǎng)    小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院上海生命科學研究院。于37，5%CO2濕潤環(huán)境中培養(yǎng), 每3天更換1次培養(yǎng)液, 細胞生長匯合成單層細胞時及時傳代, 常規(guī)培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640。    1.3  細胞生長曲線和蛋白質含量的測定    取對數(shù)生長期的細胞按3×103 個/孔接種于96孔板(Cellstar),

7、共接種16板。待細胞貼壁后，吸出孔內的培養(yǎng)液和未貼壁的細胞。各給藥組分別給予含12.5，25，50，100，200和400 g/ml  葡聚糖的培養(yǎng)液200  l，進行培養(yǎng)。每板上作對照,每個葡聚糖濃度作3個平行孔。每天定時取上述培養(yǎng)板2塊, 于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況, 然后將其中1塊板以中性紅比色法1檢測細胞生長情況,另1板用lowry法測定蛋白質含量2。以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標, 中性紅比色法測得的D值和蛋白質含量為縱坐標, 分別繪制細胞生長曲線和蛋白質變化曲線。    1.4  胞內游離鈣濃度測定  

8、;  細胞內游離鈣濃度的測定按文獻3方法進行。    1.5  cAMP濃度測定    于100 ml培養(yǎng)瓶內接種RAW264.7細胞, 待細胞生長接近匯合時給予不同濃度葡聚糖刺激, 分別于刺激后1，5和15 min 3個時間點取樣。取樣時棄培養(yǎng)液, 立即向瓶內加入1 ml 預冷的0.24 mol/L 高氯酸溶液, 用橡皮刮收集細胞,冰浴下超聲破碎細胞, 離心取上清, 以KOH中和至pH 6.3左右, 去除沉淀的高氯酸鉀, 取上清液冷凍干燥后于-20保存?zhèn)溆?。cAMP濃度測定按試劑盒(上海中醫(yī)藥大學)說明書進行。本

9、篇論文由網友投稿，讀書人只給大家提供一個交流平臺，請大家參考，如有版權問題請聯(lián)系我們盡快處理。    1.6  數(shù)據處理    實驗結果用±s表示, 以方差分析作統(tǒng)計學處理。    2  結  果    2.1  葡聚糖對RAW264.7細胞生長的影響    在相差顯微鏡下觀察, 葡聚糖對RAW264.7細胞形態(tài)無明顯影響。對生長曲線和培養(yǎng)液內蛋白質含量的作用均呈雙相性(圖1，圖2)。低濃度葡聚糖

10、對RAW264.7細胞具有促進作用, 隨著葡聚糖濃度的逐漸增大, D值也不斷升高, 至葡聚糖濃度100 g/ml時達最高峰, 與對照組(不加葡聚糖)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 但葡聚糖濃度進一步增高, D值反而下降, 當濃度為400 g/ml時幾乎完全抑制細胞增殖。    2.2  葡聚糖對RAW264.7細胞游離鈣的影響    加入葡聚糖刺激后胞內游離鈣迅速上升, 在5 min時反應達高峰, 游離鈣上升幅度與葡聚糖濃度有關(圖3)。以EGTA螯合培養(yǎng)環(huán)境中鈣離子的結果顯示，細胞外鈣離子存在與否對葡聚糖刺激

11、引起的細胞游離鈣波動有明顯影響(圖4)。提示升高的游離鈣來自細胞外Ca2+的內流。    2.3  葡聚糖對RAW264.7細胞內cAMP含量的影響    葡聚糖刺激1 min時細胞內cAMP明顯增高(P<0.01), 刺激后510 min 則cAMP含量開始下降,但仍較基礎水平高(圖5)。    3  討  論    巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)專職吞噬細胞之一,源自血液單核細胞,廣泛分布于所有組織中,成為機體抗入侵微生物的第一道防線,在機體抗

12、真菌感染中也起著重要作用。它通過免疫球蛋白受體和補體受體識別并吞噬受調理素作用的微生物;對于未經調理作用的微生物,則通過一組胚系編碼的蛋白-模式識別受體(PRRs)4迅速識別表達于微生物表面的稱作病原相關微生物模式（PAMPs)的保守微生物分子,如主要存在于革蘭陰性菌的脂多糖、革蘭陽性菌的磷脂酸以及真菌的葡聚糖等5 。葡聚糖是真菌細胞壁含量最高的多糖, 具有廣泛的生物學效用。已有研究表明, 葡聚糖可促進多種細胞活化6。我們注意到微量葡聚糖雖可促進RAW264.7細胞增生, 但對細胞結構形態(tài)無明顯作用。通過對細胞內第二信使傳遞系統(tǒng)的觀察發(fā)現(xiàn),葡聚糖可明顯增加細胞內游離鈣和cAMP。胞內游離鈣和c

13、AMP是細胞內重要的信使分子, 介導許多重要的生理功能。通過觀察細胞游離鈣和cAMP的變化, 可以了解葡聚糖信號在靶細胞內的傳導機制。    本實驗結果表明,葡聚糖刺激可在25 min內使細胞內游離鈣迅速升高, 而且在一定范圍內其上升幅度與葡聚糖劑量相關。細胞外Ca2+存在與否對葡聚糖刺激后胞內游離鈣波動有明顯影響, 提示胞內游離鈣的升高主要來源于細胞外Ca2+的內流而非細胞內鈣庫的動員。葡聚糖使細胞內cAMP濃度升高是否與葡聚糖促細胞增生作用有關, 尚有待進一步研究, 但我們的實驗結果提示, cAMP含量變化與細胞蛋白合成的量相關?！緟⒖嘉墨I】  1

14、聞 平, 何 艷, 葉慶林, 等.中性紅比色法檢測細胞增殖活性J.鎮(zhèn)江醫(yī)學院學報, 2000, 10 (1): 161-163.2 Lowry OH，Rosebrough NJ，F(xiàn)arr AL，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent J.J Biol Chem, 1951,193(1): 265-275.3 Ye QL,Wagner M，Smythe S，et al.Thyrotrophin, but not forskolin, increases intracellular free calcium and calmodulin in pig thyroid cellsJ.J Endocrinol, 1991, 129(2): 291-299.4 Diniz SN, Nomizo R, Cisalpino PS, et al.PTX3 function as an opsonin for the dectin1dependent internalization of zymosan by m