細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)-課堂-第一講細(xì)胞培養(yǎng)概述331

1、細(xì)胞培養(yǎng)概述Cell Culture細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室教研室授課對(duì)象：研究生授課對(duì)象：研究生授課教材：授課教材：細(xì)胞培養(yǎng)，司徒振強(qiáng)、吳軍正主編等主編細(xì)胞培養(yǎng)，司徒振強(qiáng)、吳軍正主編等主編， 世界世界圖書(shū)出版圖書(shū)出版西安有限公司西安有限公司授課教師：授課教師：顧蕓，王彩萍，劉曉宇顧蕓，王彩萍，劉曉宇帶帶教研究生：教研究生：一組一組負(fù)責(zé)人：彭蘇負(fù)責(zé)人：彭蘇 組員組員：龔佳歡、：龔佳歡、劉鑫、吳建成、葉永契劉鑫、吳建成、葉永契 二組二組負(fù)責(zé)人：何春嬌負(fù)責(zé)人：何春嬌 組員組員：王盛燃、張薛杰、查廣彬：王盛燃、張薛杰、查廣彬 從猛從猛 神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/神經(jīng)科學(xué)系神經(jīng)科學(xué)系學(xué)號(hào)

2、學(xué)號(hào)姓名姓名組別組別帶教帶教14180014曹澄君曹澄君超凈臺(tái)超凈臺(tái)1龔佳歡龔佳歡彭蘇彭蘇15180002印麗鋒印麗鋒15180004劉珍珍劉珍珍15180007俞盛楠俞盛楠15180009陳曉旭陳曉旭超凈臺(tái)超凈臺(tái)2劉鑫劉鑫15180010錢(qián)秀榮錢(qián)秀榮15180012朱曉玥朱曉玥15180020程鑫程鑫15180021張晟張晟超凈臺(tái)超凈臺(tái)3吳建成吳建成15180022邢鳳軍邢鳳軍15180023殷開(kāi)治殷開(kāi)治15160001李雯李雯15160003陳美美陳美美超凈臺(tái)超凈臺(tái)4葉永契葉永契15160006吉磊吉磊15160007王守艷王守艷15160010俞少露俞少露15160015吳麗婷吳麗婷超凈

3、臺(tái)超凈臺(tái)5王盛燃王盛燃何春嬌何春嬌15160016周琪周琪15160017夏瑜椰夏瑜椰15160018楊春朝楊春朝15160019季兆東季兆東超凈臺(tái)超凈臺(tái)6張薛杰張薛杰15160021王昆王昆15160022陳璐陳璐15160023何理何理15160024胡靜靜胡靜靜超凈臺(tái)超凈臺(tái)7查廣彬查廣彬15160026華橋華橋15160027單延鳳單延鳳15160028李潔瑩李潔瑩15160029張慶婕張慶婕超凈臺(tái)超凈臺(tái)8從猛從猛15160030陸建鋒陸建鋒15160031韋玉芳韋玉芳15160032薛均薛均15160033施維施維課程內(nèi)容介紹課程內(nèi)容介紹第一講：細(xì)胞概論- 4.11（周一）18:30

4、第二講：細(xì)胞株傳代培養(yǎng)- 4.12（周二）18:00 第三講：臺(tái)盼藍(lán)染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)- 4.14（周四）18:00第四講：細(xì)胞凍存及種細(xì)胞（為真核轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分裂指數(shù)做準(zhǔn)備） - 4.15（周五）18:00第五講：真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染- 4.16（周六）18:00第六講：細(xì)胞分裂指數(shù)，細(xì)胞活力鑒定及細(xì)胞固定（為細(xì)胞周期測(cè)定做準(zhǔn)備） - 4.17（周日）18:00第七講：凍存細(xì)胞復(fù)蘇、觀察轉(zhuǎn)染效果及講解細(xì)胞周期、細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果 - 4.18（周一）18:00第八講：原代細(xì)胞的培養(yǎng)- 4.19（周二）18:00第九講：觀察原代培養(yǎng)結(jié)果，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)演示，課程復(fù)習(xí)和總結(jié) - 4.21（周四）18:00？WHY

5、據(jù)據(jù)CCTV4報(bào)道，報(bào)道，13年年10月中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)臺(tái)北榮民總醫(yī)院在干細(xì)胞研究方月中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)臺(tái)北榮民總醫(yī)院在干細(xì)胞研究方面有重大突破，研究人員利用干細(xì)胞已分化出網(wǎng)膜和心肌細(xì)胞，目前面有重大突破，研究人員利用干細(xì)胞已分化出網(wǎng)膜和心肌細(xì)胞，目前該研究正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，未來(lái)有望生產(chǎn)干細(xì)胞藥品有效治療失明該研究正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，未來(lái)有望生產(chǎn)干細(xì)胞藥品有效治療失明、心臟病等、心臟病等。一口一口好牙不但能給出一個(gè)美麗的笑好牙不但能給出一個(gè)美麗的笑容，還是健康的標(biāo)志。但由于疾病容，還是健康的標(biāo)志。但由于疾病或意外事故，我們可能失去牙齒?；蛞馔馐鹿?，我們可能失去牙齒。鑲顆金牙吧，有損整體美觀?，F(xiàn)在鑲顆金

6、牙吧，有損整體美觀。現(xiàn)在好了，科學(xué)家成功利用人的尿液衍好了，科學(xué)家成功利用人的尿液衍生的細(xì)胞誘導(dǎo)形成干細(xì)胞獲得再生生的細(xì)胞誘導(dǎo)形成干細(xì)胞獲得再生牙齒雛形。牙齒雛形。7月月30日，這項(xiàng)研究成果日，這項(xiàng)研究成果刊登在學(xué)術(shù)期刊刊登在學(xué)術(shù)期刊細(xì)胞再生細(xì)胞再生上，上，同時(shí)也引發(fā)國(guó)際社會(huì)廣泛討論同時(shí)也引發(fā)國(guó)際社會(huì)廣泛討論。 CLSCLS生物治療的原理是利用自身免疫殺滅腫瘤生物治療的原理是利用自身免疫殺滅腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞。20112011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者斯坦曼博士年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者斯坦曼博士在在19731973年發(fā)現(xiàn)了激活免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞年發(fā)現(xiàn)了激活免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞DCDC細(xì)細(xì)胞。在胞。在2020世

7、紀(jì)世紀(jì)8080年代，科學(xué)家又培養(yǎng)出了具有年代，科學(xué)家又培養(yǎng)出了具有腫瘤強(qiáng)殺傷效應(yīng)的腫瘤強(qiáng)殺傷效應(yīng)的CIKCIK細(xì)胞。這兩種細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。這兩種細(xì)胞是腫瘤生物治療的關(guān)鍵。生物治療的關(guān)鍵。CLSCLS生物治療通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)萬(wàn)生物治療通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)萬(wàn)倍擴(kuò)增這兩類(lèi)細(xì)胞，再輸回患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)腫瘤倍擴(kuò)增這兩類(lèi)細(xì)胞，再輸回患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)腫瘤大面積殺傷治療。大面積殺傷治療。CLSCLS多細(xì)胞生物免疫治瘤多細(xì)胞生物免疫治瘤- -有有效延長(zhǎng)生命效延長(zhǎng)生命長(zhǎng)度長(zhǎng)度3-53-5年年, ,保證提升生物質(zhì)量保證提升生物質(zhì)量, ,實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)瘤自我康復(fù)瘤自我康復(fù) . .細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用p研究哺

8、乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律p研究細(xì)胞分化用于制造組織，器官p研究基因功能p生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物p疾病治療與治療性克隆p研究細(xì)胞癌變機(jī)理及新藥物的篩選從分子到細(xì)胞，我們?nèi)绾稳ニ伎?？從分子到?xì)胞，我們?nèi)绾稳ニ伎迹考?xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)1.活細(xì)胞：能長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活細(xì)胞：能長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)活動(dòng)2.可控制：可選擇特定的研究細(xì)胞種類(lèi)、性質(zhì)、階段可控制：可選擇特定的研究細(xì)胞種類(lèi)、性質(zhì)、階段可可控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等因素因素可可采用各種研究技術(shù)、記錄方法：采用各種研究技術(shù)、記錄方法：倒置倒置生物顯微鏡、熒

9、光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等。光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等。3.樣品均一性：來(lái)源于同一組織同一種細(xì)胞。樣品均一性：來(lái)源于同一組織同一種細(xì)胞。4.經(jīng)濟(jì)、規(guī)模和機(jī)械化經(jīng)濟(jì)、規(guī)模和機(jī)械化細(xì)胞培養(yǎng)的局限性細(xì)胞培養(yǎng)的局限性人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高,但人工所模擬的條件與體但人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同。缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同。缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互

10、間的影響。當(dāng)當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，必生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，必然發(fā)生變化。然發(fā)生變化。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無(wú)菌無(wú)菌/ /滅菌條件：滅菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過(guò)凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過(guò)濾器，濾器， 潔凈層流罩，生物安全柜，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，超凈工作臺(tái)，紫外燈，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長(zhǎng)條件：細(xì)胞生長(zhǎng)條件：純水蒸餾器，純水儀，純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶，CO2CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基

11、，血清細(xì)胞檢測(cè)條件：細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器，微孔板震蕩器， 高速離心機(jī)，移液器高速離心機(jī)，移液器 細(xì)胞保存條件：細(xì)胞保存條件：液氮罐液氮罐實(shí)驗(yàn)室安全：實(shí)驗(yàn)室安全： 生物實(shí)驗(yàn)室安全，生物實(shí)驗(yàn)室安全，P1, P2, P3 P1, P2, P3 實(shí)驗(yàn)室安全實(shí)驗(yàn)室安全設(shè)計(jì)原則：防止微生物和有害物質(zhì)的影響，要求環(huán)境整潔，空氣清新、設(shè)計(jì)原則：防止微生物和有害物質(zhì)的影響，要求環(huán)境整潔，空氣清新、無(wú)塵、干燥。細(xì)胞培養(yǎng)室按功能可分為準(zhǔn)備室，緩沖室，培養(yǎng)室。無(wú)塵、干燥。細(xì)胞培養(yǎng)室按功能可分為準(zhǔn)備室，緩沖室，培養(yǎng)室。冰箱超凈臺(tái)倒置顯微鏡離心機(jī) 載物臺(tái)櫥柜物品柜培養(yǎng)箱 恒溫

12、箱顯微鏡緩沖室培養(yǎng)室準(zhǔn)備室工作臺(tái)水池試劑柜干燥箱CellBiologyLab凈化工作室- 我國(guó)藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn) -潔凈度級(jí)別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15細(xì)胞培養(yǎng)室細(xì)胞培養(yǎng)室初級(jí)過(guò)濾高級(jí)過(guò)濾無(wú)菌空間超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái) Sterile work arealaminarflowcabinetclassII-HEPAfilter(0.3m)-UV250-270nmI

13、ncubator(humidCO2incubatorrecommended)CO2 incubator， 37oC， Appropriate CO2大容量高壓滅菌器 全自動(dòng)手提式滅菌器 濕熱滅菌裝置濕熱滅菌裝置自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀細(xì)胞培養(yǎng)用水裝置細(xì)胞培養(yǎng)用水裝置酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器水平離心機(jī)水平離心機(jī) 倒置顯微鏡倒置顯微鏡inverted microscope水浴箱水浴箱干燥箱干燥箱29Liquid N2Long-term storage of cells液氮罐液氮罐移液器濾 器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌。Zeiss濾器(過(guò)濾除菌)：培養(yǎng)基過(guò)濾除菌裝置

14、負(fù)壓負(fù)壓正壓正壓 Filtrate Filtrate ：suckfilter0.22umpressfilter0.22umMedia sterilization through a 0.22m membrane filter assembled in a filter holderA: The vacuum pumpB: Glass or plastic pipettesFiltrate培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿實(shí)驗(yàn)器材的清洗和滅菌實(shí)驗(yàn)器材的清洗和滅菌清洗的重要性清洗的重要性1. 除化學(xué)污染：鹽、油污、蛋白質(zhì)、重金屬等除化學(xué)污染：鹽、油污、蛋白質(zhì)、重金屬等2. 使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面帶負(fù)電荷，供細(xì)胞附著。使培養(yǎng)瓶

15、內(nèi)表面帶負(fù)電荷，供細(xì)胞附著。不要讓污染了的器皿變干！不要讓污染了的器皿變干！滅菌的重要性滅菌的重要性除去微生物污染除去微生物污染一、玻璃制品的一、玻璃制品的清洗清洗清洗工作包括；浸泡、超聲、浸酸、沖洗清洗工作包括；浸泡、超聲、浸酸、沖洗四步。1、浸泡；器皿在加中性洗滌劑的液體中浸泡數(shù)小時(shí)。新購(gòu)的玻璃器皿必須徹底清洗。2、超聲；在加有中性洗滌劑的超聲槽中超聲30min。3、沖洗，用水沖凈，稍涼干后浸酸。4、浸酸-清潔液，一般浸泡6h以上。以配制中等強(qiáng)度清潔液為以配制中等強(qiáng)度清潔液為例；重鉻酸鉀120g、濃硫酸200ml、蒸餾水200ml。5、沖洗，及時(shí)沖凈（不掛水為止）6、烘干。三：金屬三：金屬

16、器皿器皿金屬金屬器皿不能泡酸，器皿不能泡酸，洗洗滌滌時(shí)時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來(lái)水沖干可先用洗滌劑刷洗，后用自來(lái)水沖干凈，然后用凈，然后用75酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖洗，再烘酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干干或空氣中晾干。放放入鋁制盒內(nèi)包裝好，高壓滅菌，再烘干備用入鋁制盒內(nèi)包裝好，高壓滅菌，再烘干備用。二、塑料及橡膠二、塑料及橡膠制品制品用水浸泡用水浸泡超聲超聲沖洗沖洗浸酸（浸酸（1%鹽酸，鹽酸，6h）沖洗沖洗烘干。烘干。四、四、物品的包裝及物品的包裝及消毒消毒1、洗凈、烘干的物品應(yīng)及時(shí)包裝，常用牛皮紙、棉布、鋁盒、以洗凈、烘干的物品應(yīng)及時(shí)包裝，常用牛皮

17、紙、棉布、鋁盒、以及專(zhuān)用金屬消毒筒等。物品應(yīng)標(biāo)明品名、日期。及專(zhuān)用金屬消毒筒等。物品應(yīng)標(biāo)明品名、日期。2、消毒；、消毒；用用壓力蒸氣滅菌，玻璃器皿一般壓力蒸氣滅菌，玻璃器皿一般15壓力（壓力（ibf)-121.壓力維持壓力維持30min。培養(yǎng)用的液體以及塑料、橡膠制品常以。培養(yǎng)用的液體以及塑料、橡膠制品常以10ibf-115，維持，維持10min。過(guò)濾除菌過(guò)濾除菌；有塑料、不銹鋼微孔濾膜濾器，用正壓過(guò)濾除菌。塑；有塑料、不銹鋼微孔濾膜濾器，用正壓過(guò)濾除菌。塑料的一般為針式濾器，直徑料的一般為針式濾器，直徑25mm和和50mm兩種。不銹鋼微孔濾膜濾器有兩種。不銹鋼微孔濾膜濾器有500和和1000

18、ml兩種。除菌用微孔濾膜，孔徑為兩種。除菌用微孔濾膜，孔徑為0.22um。注意濾完后要檢。注意濾完后要檢查濾膜是否完整。查濾膜是否完整。電離電離輻輻射滅菌；核素產(chǎn)生的射滅菌；核素產(chǎn)生的r射線(xiàn)或電子加速器產(chǎn)生的加速離子輻射線(xiàn)或電子加速器產(chǎn)生的加速離子輻射物品殺細(xì)菌和微生物的方法。射物品殺細(xì)菌和微生物的方法。環(huán)氧乙烷環(huán)氧乙烷，化學(xué)滅菌。，化學(xué)滅菌。培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液體外體外培養(yǎng)離不開(kāi)細(xì)胞在體外生存和生長(zhǎng)的各種液體環(huán)境培養(yǎng)離不開(kāi)細(xì)胞在體外生存和生長(zhǎng)的各種液體環(huán)境-培養(yǎng)用液，因培養(yǎng)用液，因此其各種成份必需嚴(yán)格選擇，有嚴(yán)格的制備操作過(guò)程。此其各種成份必需嚴(yán)格選擇，有嚴(yán)格的制備操作過(guò)程。培養(yǎng)培養(yǎng)用液主要包括

19、用液主要包括:培養(yǎng)液、緩沖液、平衡鹽溶液、血清、培養(yǎng)液、緩沖液、平衡鹽溶液、血清、PH調(diào)整液、調(diào)整液、抗生素液等。所有用液均除菌后標(biāo)明名稱(chēng)、日期、抗生素液等。所有用液均除菌后標(biāo)明名稱(chēng)、日期、PH值，在適當(dāng)溫度下貯值，在適當(dāng)溫度下貯存。存。一、水與緩沖液一、水與緩沖液（一）（一）水水:是培養(yǎng)用液最主要的溶劑，是細(xì)胞賴(lài)依生存的環(huán)境。是培養(yǎng)用液最主要的溶劑，是細(xì)胞賴(lài)依生存的環(huán)境。對(duì)水質(zhì)要求高；三蒸水、去離子水、超純水。此外，水的貯存也對(duì)水質(zhì)要求高；三蒸水、去離子水、超純水。此外，水的貯存也很重要；貯存于密封、洗凈玻璃并內(nèi)，時(shí)間很重要；貯存于密封、洗凈玻璃并內(nèi)，時(shí)間2W，最好是現(xiàn)制現(xiàn)用。，最好是現(xiàn)制現(xiàn)

20、用。（二）緩沖液緩沖液 由由弱酸弱酸/弱酸強(qiáng)堿組成的鹽或弱堿弱酸強(qiáng)堿組成的鹽或弱堿/弱堿強(qiáng)酸組成的鹽如碳酸弱堿強(qiáng)酸組成的鹽如碳酸/碳酸氫鈉，碳酸氫鈉，磷酸二氫鈉磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉。細(xì)胞細(xì)胞生活環(huán)境中無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)很多，因細(xì)胞、組織的不同而不同，在所有生活環(huán)境中無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)很多，因細(xì)胞、組織的不同而不同，在所有細(xì)胞中無(wú)機(jī)鹽都以離子狀態(tài)存在。細(xì)胞中無(wú)機(jī)鹽都以離子狀態(tài)存在。培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液二、培養(yǎng)基二、培養(yǎng)基（一）、營(yíng)養(yǎng)成分：（一）、營(yíng)養(yǎng)成分： 1 1、氨基酸：主要需要以下、氨基酸：主要需要以下1212種必須氨基酸種必須氨基酸，它們，它們都是都是L L型的。型的。 2 2、單糖：六碳糖是主要

21、的能源，也是合成氨基酸的原料、單糖：六碳糖是主要的能源，也是合成氨基酸的原料， 吸吸收收能力最強(qiáng)的是葡萄糖、半乳糖最低。能力最強(qiáng)的是葡萄糖、半乳糖最低。 3 3、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，因此是必不可少的。、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，因此是必不可少的。 4 4、無(wú)機(jī)離子和微量元素：、無(wú)機(jī)離子和微量元素： 細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中除需要細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中除需要鈉、鉀、鈉、鉀、鈣、鎂鈣、鎂等基本元素外，還需要一些微量元素，鐵、鋅等基本元素外，還需要一些微量元素，鐵、鋅、錳、鉬等。培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液（二）、促

22、生長(zhǎng)因子及激素（二）、促生長(zhǎng)因子及激素體內(nèi)生長(zhǎng)需要因子的刺激、調(diào)節(jié)，體外同樣需要，愈來(lái)愈體內(nèi)生長(zhǎng)需要因子的刺激、調(diào)節(jié)，體外同樣需要，愈來(lái)愈多的實(shí)驗(yàn)證明各種激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子對(duì)于維持細(xì)胞的功能、多的實(shí)驗(yàn)證明各種激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子對(duì)于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)具有十分重要的作用。保持細(xì)胞的狀態(tài)具有十分重要的作用。（三）、滲透壓（三）、滲透壓 細(xì)胞必須生活在等滲的環(huán)境中，大多數(shù)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定的細(xì)胞必須生活在等滲的環(huán)境中，大多數(shù)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定的耐受性。人血漿的滲透壓是耐受性。人血漿的滲透壓是290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。對(duì)于大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞

23、，滲透壓在想滲透壓。對(duì)于大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260320mOsm/kg的范圍內(nèi)都適宜。的范圍內(nèi)都適宜。（四）、（四）、pH大多數(shù)細(xì)胞的適宜大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為為7.27.4，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生有害影響，培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力。造成培養(yǎng)基有害影響，培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力。造成培養(yǎng)基pH波波動(dòng)的主要物質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的動(dòng)的主要物質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2,在在封閉式培養(yǎng)過(guò)程中封閉式培養(yǎng)過(guò)程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為了解決這一很快下降。為了解決這一問(wèn)題，合成培養(yǎng)基中采用了問(wèn)題，合成培養(yǎng)基中采用了NaHCO3-CO

24、3緩沖緩沖系統(tǒng)，并采用開(kāi)系統(tǒng)，并采用開(kāi)放式培養(yǎng)的方式，使細(xì)胞產(chǎn)生的放式培養(yǎng)的方式，使細(xì)胞產(chǎn)生的CO2及時(shí)逸出培養(yǎng)器皿，再及時(shí)逸出培養(yǎng)器皿，再通過(guò)穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中的通過(guò)穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中的CO2氣體的濃度（氣體的濃度（5%），使之與培養(yǎng)），使之與培養(yǎng)基中的基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。處于平衡狀態(tài)。HCO3+H2O Na+ +HO+H2O+CO2（五）、無(wú)毒、無(wú)污染（五）、無(wú)毒、無(wú)污染體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)無(wú)任何抵抗體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)無(wú)任何抵抗力。因此，培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染、力。因此，培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染、無(wú)其他對(duì)細(xì)胞產(chǎn)

25、生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染。無(wú)其他對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染。 培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。 缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。 （六六）、培養(yǎng)基的種類(lèi)）、培養(yǎng)基的種類(lèi)合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199TC199、MEMMEM、RPMI-

26、1640RPMI-1640、DMEMDMEM等等。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿(mǎn)足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。：缺少某些成分，不能完全滿(mǎn)足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液平衡鹽溶液(balanced salt solution(balanced salt solution，BSS)BSS)又稱(chēng)生理鹽水或鹽溶液，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。配液時(shí)注意：（1）用水；配制先后順序；稱(chēng)

27、量，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等。（2）物質(zhì)的純度，常用的純度有優(yōu)級(jí)純(特級(jí)純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種。（3）物質(zhì)的可溶性，避免沉淀析出。（4）物質(zhì)的穩(wěn)定性，如葡萄糖只能在10磅下維持1520分鐘。（5）貯存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時(shí)混合和稀釋?zhuān)^(guò)濾除菌備用。常用的緩沖液：生理鹽水、PB、PBS(注意有無(wú)鈣鎂離子)、 Hanks液（含有鈣鎂離子、葡萄糖、酚紅）細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制pH調(diào)節(jié)液調(diào)節(jié)液(1)碳酸氫鈉液 可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過(guò)濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封

28、，4冰箱保存。市售有5%10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)pH過(guò)程中或超過(guò)要求值時(shí)，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調(diào)節(jié)之。(2)Hepes緩沖液 是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中pH值較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為1015mmol/L。配制時(shí)，稱(chēng)取所需的Hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，過(guò)濾除菌分裝小瓶中，4冰箱保存。消化液消化液(1) 胰蛋白酶溶液， 一種黃白色粉末，易受潮，應(yīng)密封放置陰暗干燥處。它的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開(kāi)來(lái)。常用濃度為0.25%或5%胰蛋白酶。(2) EDTA

29、(乙烯二胺與乙酸或Versene)溶液 EDTA是一種化學(xué)螯合劑，毒性小，對(duì)貼壁細(xì)胞有離散作用。一般使用濃度為0.02%。稱(chēng)0.1gVersene溶解于500ml無(wú)鈣鎂離子磷酸緩沖液中，15磅30分鐘高壓滅菌，4或室溫保存。(3) 胰蛋白酶EDTA的配制 0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4ml，無(wú)鈣鎂離子緩沖液100ml。抗生素抗生素溶液溶液在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100g 。配制時(shí)取青霉素1106和鏈霉素1106g,溶于100ml Hanks或PBS中，使其含量為青霉素1104U/ml，鏈霉素1104g/ml，使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液中加

30、入0.51ml。慶大霉素：每毫升100單位-方便、廣譜、穩(wěn)定。基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8080一一9595血清血清 5 5一一2020碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g/L2.0 g/L青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100100單位毫升單位毫升完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成血清血清中含有：中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）； 多種金屬離子；多種金屬離子； 激素；各種生長(zhǎng)因子；激素；各種生長(zhǎng)因子； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等； 胰酶抑制因子；胰酶抑制因子； 轉(zhuǎn)移蛋白；轉(zhuǎn)移蛋白； 不明成分。不明

31、成分。 血血 清清血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 56 ，30 30 分鐘。分鐘。血清的消毒：過(guò)濾除菌。血清的消毒：過(guò)濾除菌。血清的使用血清的使用一般說(shuō)來(lái)，含一般說(shuō)來(lái)，含5 5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維

32、持細(xì)胞不小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加1010血清。血清。對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)

33、工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用用無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞。血清的作用血清的作用無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作的基本操作技術(shù)技術(shù)一、無(wú)一、無(wú)菌菌技技術(shù)術(shù) 微生物污染一直是細(xì)胞培養(yǎng)的主要問(wèn)題。無(wú)菌程度梯度示意圖培養(yǎng)室的滅菌培養(yǎng)室的滅菌實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備工作面無(wú)菌原則工作面無(wú)菌原則正確的工作臺(tái)面布局正確的工作臺(tái)面布局 物品在工作臺(tái)中部潔凈區(qū)圍成新月?tīng)?，酒精燈位于中央。保持臺(tái)面整齊保持臺(tái)面整齊Good！Bad！無(wú)菌操作無(wú)菌操作凡是帶入超凈工作臺(tái)凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)瓶子內(nèi)瓶子均要用均

34、要用75酒精擦拭瓶子的外表面酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精燈火焰操作。靠近酒精燈火焰操作。玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必須過(guò)火滅菌玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必須過(guò)火滅菌打開(kāi)和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。打開(kāi)和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。無(wú)菌級(jí)別高的物品不能觸碰無(wú)菌級(jí)別低的物品。手不能從敞開(kāi)的瓶口無(wú)菌級(jí)別高的物品不能觸碰無(wú)菌級(jí)別低的物品。手不能從敞開(kāi)的瓶口上方經(jīng)過(guò)上方經(jīng)過(guò)各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。到廢液缸。吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。吸取兩種以上的使用液

35、時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。手握試管、滴管、移液管時(shí)盡量遠(yuǎn)離工作端。手握試管、滴管、移液管時(shí)盡量遠(yuǎn)離工作端。盡可能移走不需要的物品，在操作中經(jīng)常用酒精擦拭臺(tái)面。盡可能移走不需要的物品，在操作中經(jīng)常用酒精擦拭臺(tái)面。盡可能減少開(kāi)蓋時(shí)間。盡可能減少開(kāi)蓋時(shí)間。隨時(shí)擦去任何溢出物。隨時(shí)擦去任何溢出物。無(wú)菌操作無(wú)菌操作 傾倒傾倒廢液時(shí)防止濺起和瓶口回流。廢液時(shí)防止濺起和瓶口回流。 在視野范圍內(nèi)工作。在視野范圍內(nèi)工作。無(wú)菌的無(wú)菌的思想貫穿到細(xì)胞培養(yǎng)思想貫穿到細(xì)胞培養(yǎng)的任何操作的任何操作步驟步驟二、培養(yǎng)二、培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞的觀察觀察（一）肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度（二）倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞

36、的生物學(xué)細(xì)胞的生物學(xué)特征特征 1. 體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 2. 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程 3. 體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)4. 細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名 體外體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型培養(yǎng)細(xì)胞的分型 1. 貼附型：貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型多型細(xì)胞型多型細(xì)胞型2. 懸浮型：懸浮型：見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類(lèi)型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類(lèi)細(xì)胞容易大量繁殖。 胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成

37、纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類(lèi)似時(shí)皆可稱(chēng)之為成纖維細(xì)胞。 成纖維細(xì)胞型：成纖維細(xì)胞型：貼附型細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。 上皮型細(xì)胞：上皮型細(xì)胞：游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。多形細(xì)胞多形細(xì)胞型：型：有一些細(xì)胞，如神

38、經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類(lèi)。 見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類(lèi)型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類(lèi)細(xì)胞容易大量繁殖。 2. 懸浮型概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng) 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來(lái)源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)， 易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)課件73懸浮細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程 1. 1. 培養(yǎng)細(xì)胞生命期（培養(yǎng)細(xì)胞生命期

39、（Life Span of Culture CellsLife Span of Culture Cells）指細(xì)胞在整個(gè)離體培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間，分為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。2. 2. 組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所謂細(xì)胞“一代”一詞，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增( Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36次。概念概念“代代” 細(xì)胞分裂一次？ 錯(cuò)！ 培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接

40、種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)課件77原原代代培培養(yǎng)養(yǎng)傳傳代培養(yǎng)代培養(yǎng)每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期平臺(tái)期游離: 懸浮,胞質(zhì)回縮, 全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形;吸附: 貼附底物,一般24小時(shí)內(nèi)貼壁;潛伏期:可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng),基本無(wú)增殖,少見(jiàn)分裂相.細(xì)胞貼壁過(guò)程1.細(xì)胞密度：細(xì)胞密度：接種的細(xì)胞密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會(huì)較長(zhǎng)。2.細(xì)胞類(lèi)型：細(xì)胞類(lèi)型：傳代培養(yǎng)的細(xì)胞

41、潛伏期比原代培養(yǎng)的細(xì)胞短。傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞,一般為624h;原代2496h或更長(zhǎng)。單個(gè)細(xì)胞快,細(xì)胞大團(tuán)慢,組織塊慢。連續(xù)細(xì)胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(6-24h)比有限細(xì)胞系與正常二倍體細(xì)胞的短。來(lái)源：胚胎組織:短,2天可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)；成體組織:長(zhǎng)。 3.細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)：細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)：不良者慢。4.培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：培養(yǎng)液, pH, 底物等，不利：污染,有毒； 慢。滯留時(shí)間的長(zhǎng)短與：細(xì)胞種類(lèi)、接種的細(xì)胞密度、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約2496小時(shí)或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅624小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期

42、。潛伏期潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期指數(shù)生長(zhǎng)期停滯期停滯期有絲分裂指數(shù)有絲分裂指數(shù)(MI) :指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計(jì)時(shí)，每瓶至少需計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞的MI約為0.1 0.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3% 5%。細(xì)胞細(xì)胞群體倍增時(shí)間：群體倍增時(shí)間： 培養(yǎng)物種中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)間MTT法：法： 反映細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體中一種酶活性程度標(biāo)記核苷酸標(biāo)記核苷酸(3H-TdR)摻入量摻入量：反映DNA合成判斷細(xì)胞生長(zhǎng)的指標(biāo)判斷細(xì)胞生長(zhǎng)的指標(biāo)：指數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)細(xì)胞分裂活動(dòng)的程度(增殖活性)可作為判斷細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的重要指標(biāo)。1. 1. 初初代培養(yǎng)代培養(yǎng)

43、 又稱(chēng)原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱(chēng)為初代培養(yǎng)，而改稱(chēng)為細(xì)胞系。2. 2. 細(xì)胞系細(xì)胞系 初代培養(yǎng)物開(kāi)始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱(chēng)之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱(chēng)之為有限細(xì)胞系；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無(wú)異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說(shuō)明已惡性化。3. 3. 細(xì)胞株細(xì)胞株 從一個(gè)經(jīng)過(guò)

44、生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱(chēng)細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱(chēng)之為亞株。體外體外培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)的種類(lèi) 4. 4. 二倍體二倍體細(xì)胞細(xì)胞 細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75或80以上）的細(xì)胞群，稱(chēng)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不同，二倍體細(xì)胞的壽命長(zhǎng)短各異。人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50代土10代，人胚腎只有810代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞1530代。由不同年

45、齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初代或25代即大量?jī)龃孀鳛樵N，用時(shí)再進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長(zhǎng)期使用或延緩細(xì)胞的衰老。5 5. . 遺傳缺陷細(xì)胞遺傳缺陷細(xì)胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。6 6. . 腫瘤細(xì)胞系或株腫瘤細(xì)胞系或株 這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類(lèi)，我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類(lèi)細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類(lèi)上皮型細(xì)胞，已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。 HeLa： 為供體患者的姓名（來(lái)源于宮頸癌）

46、CHO： 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary）宮-743： 宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）建立； 每3天傳代，每次接種3105細(xì)胞毫升。細(xì)胞系細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名或細(xì)胞株的命名 細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用 培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：組織來(lái)源日期、物種、組織起源、性別、年齡、 供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等；凍凍 存存 液：液：培養(yǎng)基和防凍液名稱(chēng)；細(xì)胞活力：細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性；培培 養(yǎng)養(yǎng) 液：液：培養(yǎng)基種類(lèi)和名稱(chēng)（一般要求不含抗生素）、血清來(lái)源和含量；細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞形態(tài)：類(lèi)型，如為上皮或成纖維細(xì)胞

47、等，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性核核 型：型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無(wú)無(wú)污染檢測(cè)：無(wú)污染檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲(chóng)和病毒等物種檢測(cè)：物種檢測(cè)：檢測(cè)同工酶，主要為G6PD和LDH， 以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)免疫檢測(cè)：免疫檢測(cè)：一兩種血清學(xué)檢測(cè)細(xì)胞建立者：細(xì)胞建立者：建立者姓名；檢測(cè)者姓名如：ATCC入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目同時(shí)附有照片（高低密度）細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒。無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等是主要的污染源。 嚴(yán)格的無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。 肉眼直接

48、觀察法、培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法細(xì)菌和真菌的污染和檢測(cè)支原體的污染和檢測(cè)造成支原體高污染率的原因有多種 1. 支原體大小0.10.8 m，無(wú)細(xì)胞壁，可透過(guò)一般過(guò)濾膜（0.22-0.45 m ）；2. 支原體污染時(shí)，沒(méi)有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化 ；3. 過(guò)去缺乏簡(jiǎn)單、快速且可靠的檢測(cè)方式；4. 細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染；5. 研究或操作人員忽略污染問(wèn)題；6. 已受污染的細(xì)胞、培養(yǎng)基、血清 等。 相差顯微鏡觀察法 Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法 DNA熒光染色法 PCR方法 特異引物擴(kuò)增支原體 DNA支原體的檢測(cè)支原體污染后的抗生素處理: 第一種方法：使

49、用泰樂(lè)菌素（tylosin，Sigma)，泰樂(lè)菌素是一種獸用抗生素,常用在雞、豬的食料輔料，可以防止支原體感染引起的支氣管哮喘，至今尚未見(jiàn)有耐藥菌株，是治療支原體感染的特效藥。第二種方法：M-Plasmocin, InvivoGen公司研究開(kāi)發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過(guò)的培養(yǎng)細(xì)胞，不會(huì)重新感染支原體。第三種方法：用BM-Cyclin-1/2，效果很好，方法如下：細(xì)胞傳代同時(shí)加BM-Cyclin-1 10g/ml，37培養(yǎng)3天，加入BM-Cyclin-2 5 g/ml，37培養(yǎng)3天；（不需傳代，因?yàn)橹гw

50、污染的細(xì)胞生長(zhǎng)非常慢?。┤绻?xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)正常，即可結(jié)束。否則加BM-Cyclin-1 20 g/ml，37培養(yǎng)3天，加入BM-Cyclin-2 10 g/ml，37培養(yǎng)3天。懷疑是支原體污染的就可以試試，對(duì)細(xì)胞不會(huì)有太大影響。3. 病毒的污染和檢測(cè) 細(xì)胞的直接觀察 動(dòng)物接種檢查 電子顯微鏡觀察 免疫學(xué)檢查 PCR技術(shù)常用抗生素用量和效應(yīng)抗生素抗菌譜細(xì)菌 真菌 支原體 常用濃度青霉素 G+ 100IU/ml鏈霉素 G- 100g/ml慶大霉素 G+,G- 200g/ml四環(huán)素 G+,G- 10g/ml 卡那霉素 G+,G- 50g/ml 兩性霉素 2 g/ml 制霉菌素 25 g/ml 細(xì)胞培養(yǎng)

51、中的研究細(xì)胞培養(yǎng)中的研究方法方法內(nèi)容提要內(nèi)容提要一、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況觀察一、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況觀察二、細(xì)胞活力測(cè)定二、細(xì)胞活力測(cè)定三、細(xì)胞凋亡檢測(cè)三、細(xì)胞凋亡檢測(cè)四、流式細(xì)胞術(shù)四、流式細(xì)胞術(shù)五、常用單細(xì)胞分離五、常用單細(xì)胞分離技術(shù)技術(shù)六、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染六、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染一、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況觀察一、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況觀察 1 1. .常規(guī)觀察常規(guī)觀察 2 2. .細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 3 3. .細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn) 4 4. .細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù) 5.5.細(xì)胞貼壁率細(xì)胞貼壁率 6.6.細(xì)胞周期細(xì)胞周期 1. 1.常規(guī)觀察常規(guī)觀察 倒置顯微鏡倒置顯微鏡下觀察，生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞透明度大，細(xì)胞內(nèi)下觀察，生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞透明度大，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，沒(méi)有空泡。包膜清晰。培養(yǎng)液清澈透明，無(wú)懸浮細(xì)胞顆粒少，沒(méi)有空泡。包膜