第二章動物細胞培養(yǎng)

1、第二章第二章 動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)Hela細胞株細胞株人正常胎肝細胞系人正常胎肝細胞系動物細胞培養(yǎng)的發(fā)展歷史動物細胞培養(yǎng)的發(fā)展歷史18591859年年, ,法國解剖學家法國解剖學家ValpianValpian最早嘗試最早嘗試了蛙胚尾部組織的體外培養(yǎng)了蛙胚尾部組織的體外培養(yǎng). .18851885年，年，Wilhelm RouxWilhelm Roux把雞胚的神把雞胚的神經(jīng)板在溫熱的鹽水中維持其存活若干天；經(jīng)板在溫熱的鹽水中維持其存活若干天；19061906年，年，BeebeBeebe和和EwingEwing在動物的血液在動物的血液中嘗試培養(yǎng)了傳染性狗淋巴肉瘤的細胞；中嘗試培養(yǎng)了傳染性狗淋巴肉

2、瘤的細胞； 19071907，美國的哈里森使用蓋玻片懸滴，美國的哈里森使用蓋玻片懸滴培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織細胞；培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織細胞； 2020世紀初，世紀初，CarrelCarrel將外科手術(shù)的無菌操將外科手術(shù)的無菌操作觀念帶到了體外培養(yǎng)的實驗之中。作觀念帶到了體外培養(yǎng)的實驗之中。Ross Granville Harrison 18701959, American biologist and anatomist, b. Germantown, Pa., Ph.D. Johns Hopkins, 1894. He went to Yale as professor of comparative an

3、atomy in 1907 and held various honorary positions there until his death. He is known for his work on nerve development in the embryo and on nerve regeneration as well as for his discovery of a method of tissue culture that permits study of isolated living cells in a controlled environment. HarrisonH

4、arrison：組織培養(yǎng)之父：組織培養(yǎng)之父 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1912in recognition of his work on vascular suture and the transplantation of blood vessels and organsAlexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873d. 1944動物細胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語動物細胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語v細胞培養(yǎng)；組織培養(yǎng)；器官培養(yǎng)

5、細胞培養(yǎng)；組織培養(yǎng)；器官培養(yǎng)v原代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)；代原代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)；代v細胞系；細胞株細胞系；細胞株v有限細胞系；無限細胞系有限細胞系；無限細胞系v體外轉(zhuǎn)化；體外惡性轉(zhuǎn)化體外轉(zhuǎn)化；體外惡性轉(zhuǎn)化v細胞分裂指數(shù)；克隆形成率細胞分裂指數(shù)；克隆形成率第一節(jié)第一節(jié) 細胞培養(yǎng)需要具備的基本條件細胞培養(yǎng)需要具備的基本條件體外培養(yǎng)細胞的基本特征體外培養(yǎng)細胞的基本特征影響細胞體外培養(yǎng)的理化因素影響細胞體外培養(yǎng)的理化因素細胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)置設(shè)備細胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)置設(shè)備器具的清洗與無菌操作器具的清洗與無菌操作（一）體外培養(yǎng)細胞的分型（一）體外培養(yǎng)細胞的分型.貼附型：貼附型：一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性一、體外培養(yǎng)

6、細胞的基本特性2.2.懸浮型：懸浮型：成纖維型細胞成纖維型細胞上皮型細胞上皮型細胞游走型細胞游走型細胞多形型細胞多形型細胞按照體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)，可以分為：按照體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)，可以分為：1. 1. 粘附型粘附型成纖維型細胞成纖維型細胞上皮型細胞上皮型細胞游走型細胞游走型細胞多形型細胞多形型細胞 2.2.懸浮型：懸浮型： 形態(tài)？形態(tài)？ 來源？來源？ 生長特點？生長特點？（二）體外培養(yǎng)細胞的超微結(jié)構(gòu)（二）體外培養(yǎng)細胞的超微結(jié)構(gòu)v細胞外被：細胞外被：糖蛋白膜，利于細胞貼壁。糖蛋白膜，利于細胞貼壁。一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性v 細胞骨架：細胞骨架：正常細胞微絲微管走行有一

7、定正常細胞微絲微管走行有一定 方向性，轉(zhuǎn)化后行走紊亂。方向性，轉(zhuǎn)化后行走紊亂。v 細胞核：細胞核：與體內(nèi)正常細胞差不多。與體內(nèi)正常細胞差不多。v 細胞器：細胞器：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等 多集中在細胞核周圍。多集中在細胞核周圍。（三）體外培養(yǎng)細胞的生長和增殖特性（三）體外培養(yǎng)細胞的生長和增殖特性 一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性增殖態(tài)增殖態(tài): 指細胞增殖的狀態(tài)和過程指細胞增殖的狀態(tài)和過程功能態(tài)功能態(tài): 細胞處于執(zhí)行特定功能活動（如分泌、細胞處于執(zhí)行特定功能活動（如分泌、 傳導(dǎo)、吞噬、收縮等）時期的狀態(tài)傳導(dǎo)、吞噬、收縮等）時期的狀態(tài)1. 培養(yǎng)細胞的

8、增殖態(tài)和功能態(tài)培養(yǎng)細胞的增殖態(tài)和功能態(tài)一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性（三）體外培養(yǎng)細胞的生長和增殖特性（三）體外培養(yǎng)細胞的生長和增殖特性 2.培養(yǎng)細胞生命期培養(yǎng)細胞生命期（Life Span of Culture Cells） 細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間，細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間，通常以體外最終可以傳代的次數(shù)表示。通常以體外最終可以傳代的次數(shù)表示。原代培養(yǎng)期：原代培養(yǎng)期：傳代期：傳代期：衰退期：衰退期：正常細胞生正常細胞生命期大致經(jīng)命期大致經(jīng)歷歷3個階段個階段可見細胞分裂，但不旺盛可見細胞分裂，但不旺盛原代培養(yǎng)期細胞原代培養(yǎng)期細胞的主要特點：的主要特點：細胞

9、群是異質(zhì)的（細胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous）細胞克隆形成率細胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低很低初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型是檢測藥物很好的實驗對象是檢測藥物很好的實驗對象 持續(xù)時間長持續(xù)時間長傳代培養(yǎng)期細胞傳代培養(yǎng)期細胞的主要特點：的主要特點： 需早期凍存需早期凍存 細胞增殖旺盛，能維持二倍體核型細胞增殖旺盛，能維持二倍體核型細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖； 衰退培養(yǎng)期細胞衰退培養(yǎng)期細胞的主要特點：的主要特點：細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。注注: 細胞永生性和惡性

10、性非同一性狀。細胞永生性和惡性性非同一性狀。無限細無限細胞系胞系或或連續(xù)細連續(xù)細胞系胞系3. 3. 細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：潛伏期潛伏期指數(shù)增生期指數(shù)增生期平頂期平頂期潛伏期的潛伏期的特點特點細胞由游離逐漸貼附細胞由游離逐漸貼附細胞可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相細胞可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期志細胞已進入指數(shù)增生期細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程如細胞種類、支持物、促貼附物質(zhì)相關(guān)的過

11、程如細胞種類、支持物、促貼附物質(zhì)等。等。潛伏期出現(xiàn)潛伏期出現(xiàn)的原因？的原因？影響潛伏期影響潛伏期長短的因素？長短的因素？是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段指數(shù)增生期指數(shù)增生期特點特點細胞群體均一，是理想的實驗用細胞細胞群體均一，是理想的實驗用細胞培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長接觸抑制？接觸抑制？腫瘤細胞接觸抑制消失腫瘤細胞接觸抑制消失停滯期停滯期特點特點細胞數(shù)量達飽和密度，出現(xiàn)密度抑制細胞數(shù)量達飽和密度，出現(xiàn)密度抑制細胞活動小細胞活動小, 細胞膜的活動小細胞膜的活動小生長組分下降生長組分下降: 010%及時傳代：及時傳代：（四）體內(nèi)外細胞

12、的差異（四）體內(nèi)外細胞的差異一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性一、體外培養(yǎng)細胞的基本特性1.形態(tài)的差異：形態(tài)的差異：細胞體外培養(yǎng)形態(tài)，細胞體外培養(yǎng)形態(tài)， 難以完全反應(yīng)體內(nèi)情況。難以完全反應(yīng)體內(nèi)情況。2.分化的差異：分化的差異：體內(nèi)細胞聽命于外源信號，體內(nèi)細胞聽命于外源信號， 體外細胞信號來源切斷，出現(xiàn)體外細胞信號來源切斷，出現(xiàn) 特定基因分化表達減弱或停止。特定基因分化表達減弱或停止。 無菌、無毒：無菌、無毒：體外培養(yǎng)細胞的首要條件。體外培養(yǎng)細胞的首要條件。二、影響細胞培養(yǎng)的理化因素二、影響細胞培養(yǎng)的理化因素 支持物：支持物：表面理化性質(zhì)，細胞與其接觸的機會表面理化性質(zhì)，細胞與其接觸的機會 和親和性等。

13、和親和性等。 營養(yǎng)條件：營養(yǎng)條件：葡萄糖；氨基酸與蛋白質(zhì)；維生素葡萄糖；氨基酸與蛋白質(zhì)；維生素 與生物活性因子等與生物活性因子等 滲透壓：滲透壓：260-320 mmol/l水：水：三蒸水或超純水，存放時間一般不超過三蒸水或超純水，存放時間一般不超過2周周 氣體：氣體：氧，二氧化碳氧，二氧化碳 pH：7.2-7.4 溫度溫度：哺乳動物細胞：哺乳動物細胞370.5動物細胞動物細胞培養(yǎng)實驗室的培養(yǎng)實驗室的設(shè)置設(shè)備設(shè)置設(shè)備風淋室風淋室 傳遞窗傳遞窗CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱倒置顯微鏡倒置顯微鏡 大容量高壓滅菌器大容量高壓滅菌器 全自動三重純水蒸餾器全自動三重純水蒸餾器 超純水裝置超純水裝置濾 器Zeiss

14、Zeiss濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌等均采用濾過法除菌 酶標儀酶標儀 微孔板震蕩器微孔板震蕩器液氮罐液氮罐 移液器移液器四、器具的清潔與無菌操作四、器具的清潔與無菌操作( (一一) )常用器具的清洗常用器具的清洗1.1.玻璃器皿玻璃器皿 清水浸泡清水浸泡 軟毛刷沾洗滌劑刷洗軟毛刷沾洗滌劑刷洗 自來水沖洗自來水沖洗 晾干晾干 酸液浸泡酸液浸泡過夜過夜 自來水沖洗自來水沖洗1010次以上次以上 三蒸三蒸水漂洗三次水漂洗三次 烘干備用烘干備用酸液的配制酸液的配制2. 塑料及橡膠制品塑料及橡

15、膠制品清水浸泡清水浸泡 2%NaOH浸泡過夜浸泡過夜 自自來水沖洗來水沖洗 5%稀鹽酸浸泡稀鹽酸浸泡30分鐘分鐘 自來水沖洗自來水沖洗10次以上次以上 三蒸水漂洗三蒸水漂洗3次次 晾干備用晾干備用3.金屬制品的清洗金屬制品的清洗 毛刷沾洗凈劑刷洗或毛刷沾洗凈劑刷洗或75%酒精擦洗酒精擦洗 自來水反復(fù)沖洗自來水反復(fù)沖洗 三蒸水漂洗三蒸水漂洗3次次 烘干備用烘干備用無菌室與工作臺消毒無菌室與工作臺消毒( (二二) )器具的滅菌與消毒器具的滅菌與消毒金屬器械、橡膠和塑料制品的消毒金屬器械、橡膠和塑料制品的消毒玻璃器皿消毒玻璃器皿消毒第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基及各種細胞培養(yǎng)用液培養(yǎng)基及各種細胞培養(yǎng)用液培養(yǎng)液

16、培養(yǎng)液細胞培養(yǎng)其他常用液細胞培養(yǎng)其他常用液 消化液消化液 pH調(diào)整液調(diào)整液 抗生素液抗生素液天然培養(yǎng)液天然培養(yǎng)液人工合成培養(yǎng)液人工合成培養(yǎng)液無血清培養(yǎng)液無血清培養(yǎng)液平衡鹽溶液平衡鹽溶液1.平衡鹽溶液（平衡鹽溶液（BSS） 同時具備同時具備緩沖液的緩沖能力緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲性生理鹽水的等滲性以及以及培養(yǎng)液的培養(yǎng)液的營養(yǎng)供應(yīng)營養(yǎng)供應(yīng)等特點。等特點。 血清、水解乳蛋白、胚胎浸出液、血清、水解乳蛋白、胚胎浸出液、組織液、淋巴液和血漿等組織液、淋巴液和血漿等血清種類血清種類血清質(zhì)量判定標準血清質(zhì)量判定標準血清中所含的大體成分血清中所含的大體成分2. 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基血清中所含大體成分血

17、清中所含大體成分v多種蛋白質(zhì)（白蛋白，球蛋白，鐵蛋白多種蛋白質(zhì)（白蛋白，球蛋白，鐵蛋白 及轉(zhuǎn)移蛋白等）及轉(zhuǎn)移蛋白等）v多種金屬離子多種金屬離子v激素激素v促貼附物質(zhì)促貼附物質(zhì)v各種生長因子各種生長因子v不明成分不明成分血清的優(yōu)缺點血清的優(yōu)缺點血清的使用方法血清的使用方法3.3.人工合成培養(yǎng)基：人工合成培養(yǎng)基： 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬而成。而成。幾種常用合成培養(yǎng)基幾種常用合成培養(yǎng)基MEMMEM： 低限量低限量EagleEagle培養(yǎng)基培養(yǎng)基Mccoys 5A：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細胞原代培養(yǎng)、難以培

18、養(yǎng)的細胞M199、109培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：Morgan研制成功研制成功F12：具有十分復(fù)雜的組分，適合進行單細胞培養(yǎng)和克隆化培養(yǎng)具有十分復(fù)雜的組分，適合進行單細胞培養(yǎng)和克隆化培養(yǎng)RPMI1640：Moor等研制成功，懸浮、腫瘤、原代、傳代等細胞等研制成功，懸浮、腫瘤、原代、傳代等細胞DMEM：Dulbeccos Modified Eagle Medium，貼壁細胞，貼壁細胞常用細胞常用細胞系培養(yǎng)基系培養(yǎng)基的的選擇？選擇？天然培養(yǎng)基與人工合成培養(yǎng)基的比較天然培養(yǎng)基與人工合成培養(yǎng)基的比較培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好培養(yǎng)效果好來源受限，

19、成分復(fù)雜，來源受限，成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的的提取和實驗結(jié)果的分析，易發(fā)生分析，易發(fā)生支原體污染支原體污染人工合成人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基標準化生產(chǎn)，組標準化生產(chǎn)，組成和含量相對固成和含量相對固定，成本低定，成本低缺少某些成分，不能缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生完全滿足體外細胞生長需要長需要 4. 4.無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基+替代血清的補充成分替代血清的補充成分v胰蛋白酶液胰蛋白酶液:牛胰臟中提取的黃白色粉末，牛胰臟中提取的黃白色粉末，作用強烈，對細胞傷害大。作用強烈，對細胞傷害大。vEDTA液液:通過鏊合鈣離子等，改變細胞間通過

20、鏊合鈣離子等，改變細胞間的連接，使組織或細胞分散成單個細胞的連接，使組織或細胞分散成單個細胞 v膠原酶液：膠原酶液：細菌中提取，作用溫和。細菌中提取，作用溫和。5.消化液消化液表表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別項項 目目 胰蛋白酶胰蛋白酶 膠原酶膠原酶消化特性組織消化特性組織 適用于消化軟組織適用于消化軟組織 適用于消化纖維多的適用于消化纖維多的用用 量量 0.01%0.5% 0.1 0.3mg/ml 消化時間消化時間 0.52小時（小塊）小時（小塊） 112小小pH 89 6.57.0作用強度作用強度 強烈強烈 緩和緩和細胞影響細胞影響 時間過長有影響時

21、間過長有影響 無大影響無大影響血清鈣鎂離子血清鈣鎂離子 有影響有影響 無影響無影響6.pH調(diào)整液調(diào)整液vNaCO3溶液：常用濃度有溶液：常用濃度有7.4%， 5.6%和和3.7%三種三種vHepes液：羥乙基哌嗪乙璜酸，氫液：羥乙基哌嗪乙璜酸，氫離子緩沖劑離子緩沖劑第三節(jié)第三節(jié) 原代及傳代細胞培養(yǎng)原代及傳代細胞培養(yǎng)一、一、 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 也稱初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細也稱初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細胞后在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不胞后在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)過程。分割培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)過程。組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法離散細胞培養(yǎng)法離散細胞培養(yǎng)法 鼠鼠胚胚組組織織取

22、取材材 雞鴨鳥類胚胎組織取材雞鴨鳥類胚胎組織取材 組組織織塊塊培培養(yǎng)養(yǎng)法法分分散散細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)法法機機械械分分散散法法 方法方法: 計數(shù)板的準備計數(shù)板的準備 染色染色 加懸液加懸液 鏡檢鏡檢細胞計數(shù)細胞計數(shù)動動物物細細胞胞原原代代培培養(yǎng)養(yǎng)過過程程圖圖 思考：傳代前為何要換液？怎樣判斷污染？思考：傳代前為何要換液？怎樣判斷污染？組織塊培養(yǎng)結(jié)果組織塊培養(yǎng)結(jié)果離散細胞培養(yǎng)結(jié)果離散細胞培養(yǎng)結(jié)果根據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有根據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有3 3種：種：懸浮生長細胞傳代懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心法傳代： 直接傳代法：直接傳代法：半懸浮生長細胞傳代（半懸浮生長細胞傳代（HelaH

23、ela細胞）細胞）貼壁生長細胞傳代貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.250.25的的胰蛋白酶液。胰蛋白酶液。二、傳代培養(yǎng)二、傳代培養(yǎng)三、細胞系或細胞株的命名和建系三、細胞系或細胞株的命名和建系 HeLaHeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每）建立；每3天傳一代，每次接種天傳一代，每次接種3105細胞毫升。細胞毫升。CHO：中國地鼠卵巢細胞（中國地鼠卵巢細胞（Chinese Hamster

24、 Ovary）宮宮-743：宮頸癌上皮細胞，宮頸癌上皮細胞，1974年年3月建立月建立 細胞的命名無嚴格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用細胞的命名無嚴格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義的縮寫字或代號表示。有一定意義的縮寫字或代號表示。四、體外培養(yǎng)細胞的純化四、體外培養(yǎng)細胞的純化懸浮細胞純化懸浮細胞純化：貼壁細胞純化貼壁細胞純化：密度梯度離心密度梯度離心 含固化抗體的細胞分離柱含固化抗體的細胞分離柱依據(jù)貼壁速度不同依據(jù)貼壁速度不同 依據(jù)對消化酶敏感性不同依據(jù)對消化酶敏感性不同第四節(jié)第四節(jié) 培養(yǎng)細胞的常規(guī)檢測培養(yǎng)細胞的常規(guī)檢測微生物污染的檢測與排除微生物污染的檢測與排除生長與增殖特性的檢測生長與增殖特性的檢測 細胞

25、形態(tài)觀察細胞形態(tài)觀察（一）微生物污染的途徑及預(yù)防（一）微生物污染的途徑及預(yù)防微生物污染的途徑有哪些？微生物污染的途徑有哪些？對細胞培養(yǎng)實驗有何啟示？對細胞培養(yǎng)實驗有何啟示？1.1.真菌污染的檢測：真菌污染的檢測：顯微鏡觀察顯微鏡觀察（二）微生物污染的檢測（二）微生物污染的檢測2.細菌污染的檢測細菌污染的檢測肉眼觀察培養(yǎng)液是否混濁肉眼觀察培養(yǎng)液是否混濁,顏色是否變黃顏色是否變黃顯微鏡下觀察是否有菌體顯微鏡下觀察是否有菌體取培養(yǎng)液進行細菌培養(yǎng)是否出現(xiàn)菌落取培養(yǎng)液進行細菌培養(yǎng)是否出現(xiàn)菌落3.支原體污染的檢測支原體污染的檢測v高倍相差顯微鏡檢測高倍相差顯微鏡檢測v地衣紅染色法檢測地衣紅染色法檢測v熒光

26、法檢測熒光法檢測v電子顯微鏡檢測電子顯微鏡檢測3.支原體污染的檢測支原體污染的檢測支原體電鏡照片支原體電鏡照片,煎蛋狀煎蛋狀熒光染色熒光染色細胞病變效應(yīng)檢測細胞病變效應(yīng)檢測正常的正常的BHK-21細胞細胞 BHK-21細胞病變圖細胞病變圖 4.病毒污染的檢測病毒污染的檢測4.病毒污染的檢測病毒污染的檢測血細胞吸附檢測血細胞吸附檢測4.病毒污染的檢測病毒污染的檢測v細胞病變效應(yīng)檢測細胞病變效應(yīng)檢測vPCR檢測檢測v免疫學方法檢測免疫學方法檢測v血細胞吸附檢測血細胞吸附檢測v電子顯微鏡檢測電子顯微鏡檢測（三）微生物污染的排除（三）微生物污染的排除v抗生素抗生素v加溫法加溫法v巨噬細胞吞噬法巨噬細胞

27、吞噬法v動物體內(nèi)接種法動物體內(nèi)接種法二、細胞形態(tài)觀察二、細胞形態(tài)觀察v光學顯微鏡：光學顯微鏡：細胞形狀、細胞大細胞形狀、細胞大小、核質(zhì)比、核仁大小及多少等小、核質(zhì)比、核仁大小及多少等v電子顯微鏡：電子顯微鏡：微絨毛、橋粒、微微絨毛、橋粒、微管微絲、核仁的形態(tài)及數(shù)量等管微絲、核仁的形態(tài)及數(shù)量等三、生長增殖特性的檢測三、生長增殖特性的檢測生長曲線：細胞群體倍增時間生長曲線：細胞群體倍增時間有絲分裂指數(shù)有絲分裂指數(shù)(MI)： MTT法：法：標記核苷酸標記核苷酸(3H-TdR)摻入量：摻入量：克隆形成率：克隆形成率：第五節(jié)第五節(jié) 無限細胞系的建立無限細胞系的建立v癌細胞體外培養(yǎng)的特性癌細胞體外培養(yǎng)的特性 v腫瘤細胞的建系方法腫瘤細胞的建系方法 一、癌細胞體外培養(yǎng)特性一、癌細胞體外培養(yǎng)特性v癌細胞形態(tài)特征：癌細胞形態(tài)特征： 核質(zhì)比增大，核仁核質(zhì)比增大，核仁增大增多，核糖體顆粒豐富增大增多，核糖體顆粒豐富v癌細胞的遺傳特性：癌細胞的遺傳特性：異倍體或多倍體異倍體或多倍體核型，染色體片段的移位與缺失，癌基核型，染色體片段的移位與缺失，癌基因特異表達等因特異表達等v癌細胞的浸潤性：癌細胞的浸潤性：v癌細胞的生長特性：癌細胞的生長特性：永生性，血清依賴永生性，血清依賴小，克隆形成率高小，克隆形成率高v體內(nèi)癌細胞的原代培養(yǎng)：如體內(nèi)癌細胞的原代培養(yǎng)