畢業(yè)論文實驗步驟

1、5.1.1實驗過程5.1.1.1SM-GA-BSA抗原的制備5.1.1.1.1SM與BSA的初始比對偶聯(lián)效果的影響1、pH9.6的碳酸鹽緩沖液的配制；稱取碳酸鈉10.2g及碳酸氫鈉16.8g溶于雙蒸水中定容至6000ml；4 冰箱保存?zhèn)溆茫?、稱取五組200mgBSA分別溶于50mlpH9.6的碳酸鹽緩沖液中，獲得A、B、C、D、E溶液；3、分別稱取50mg、100mg、200mg、400mg、800mg鏈霉素，并將其分別溶于50mlpH9.6的碳酸鹽緩沖液中，獲得a、b、c、d、e溶液；4、將Aa、Bb、Cc、Dd、Ee混合，再分別向五組中緩慢加入0.2mL25%的戊二醛，邊加邊攪拌。；5、

2、將加入戊二醛后的五組溶液置于室溫下攪拌反應(yīng)6h；6、0.01mol/L、pH7.4PBS緩沖液的配制；稱取8.0g NaCl、0.1g KCl、2.9g Na2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4,加雙蒸水溶解，定容至1000mL，4 冰箱保存?zhèn)溆茫?、反應(yīng)完后用pH7.4的PBS緩沖液透析1d；8、透析完后對每組進行SDS-PAGE凝膠電泳，看偶聯(lián)是否成功；9、將鏈霉素，BSA、五個組的偶聯(lián)抗原用碳酸鹽緩沖稀釋成一定濃度，用碳酸鹽緩沖液作對照，進行紫外掃描；10、根據(jù)紫外掃描結(jié)果計算偶聯(lián)比，確定鏈霉素與BSA的最佳初始量x。5.1.1.1.2戊二醛的量對偶聯(lián)效果的影響1、稱

3、取五組鏈霉素與BSA（第一組實驗的最佳初始量x）分別溶于碳酸鹽緩沖液中，獲得A、B、C、D、E溶液；2、向每組分別緩慢加入0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL25%戊二醛，邊加邊攪拌，獲得a、b、c、d、e溶液，將其置于室溫下攪拌反應(yīng)6h；3、反應(yīng)完后用pH7.4的PBS緩沖液透析1d；4、透析完后對每組進行SDS-PAGE凝膠電泳，看偶聯(lián)是否成功；5、將鏈霉素，BSA、五個組的偶聯(lián)抗原用碳酸鹽緩沖稀釋成一定濃度，用碳酸鹽緩沖液作對照，進行紫外掃描；6、根據(jù)紫外掃描結(jié)果計算偶聯(lián)比，確定戊二醛的最佳加入量y。5.1.1.1.3偶聯(lián)時間對偶聯(lián)效果的影響1、稱取五組一定質(zhì)量的鏈

4、霉素、BSA（第一組實驗的最佳初始量x），并將其溶于100mL的碳酸鹽緩沖液中；2、分別向五個組中加入一定量的戊二醛（第二組實驗的最佳加入量y），邊加邊攪拌；3、將五個組置于室溫下，分別攪拌反應(yīng)2h、4h、6h、8h、10h；4、待每組反應(yīng)完后，用pH7.4PBS緩沖液透析1d；5、透析完后對每組進行SDS-PAGE凝膠電泳，看偶聯(lián)是否成功；6、將鏈霉素，BSA、五個組的偶聯(lián)抗原用碳酸鹽緩沖稀釋成一定濃度，用碳酸鹽緩沖液作對照，進行紫外掃描；7、根據(jù)紫外掃描結(jié)果計算偶聯(lián)比，確定最佳反應(yīng)時間t。5.1.1.2鏈霉素-GA-OVA包被原的制備其方法與SM-GA-BSA抗原的制備相同。5.1.1.3

5、根據(jù)以上三組實驗，利用正交法分析出鏈霉素在用戊二醛合成抗原時的最優(yōu)條件1、根據(jù)上述三組實驗的x，y，t對應(yīng)分別設(shè)置三個變量；2、對鏈霉素與戊二醛的初始比變量進行設(shè)置，x-1、x、x+1；3、對戊二醛的量進行設(shè)置，y-0.1、y、y+0.1；4、對偶聯(lián)時間進行設(shè)置，t-2、t、t+2；5、設(shè)計三因素三水平的正交試驗；6、對正交實驗結(jié)果進行方差分析、F檢驗，確定出最優(yōu)偶聯(lián)條件。5.1.1.4對不同偶聯(lián)條件下的偶聯(lián)液進行SDS-PAGE凝膠電泳：1.各種溶液配制：30%丙烯酰胺：準(zhǔn)確稱取29g丙烯酰胺和0.8 g 雙丙烯酰胺溶于60mL雙蒸水中，于37溶解，然后補雙蒸水至100mL，棕色瓶4保存濃縮

6、膠緩沖液(1mol/L Tris-HCl，pH6.8)：6.06gTris溶解在40mL雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，再用雙蒸水加至50mL，4保存分離膠緩沖液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8):9.08gTris溶解在40mL雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.8，再用雙蒸水加至50mL，4保存10%SDS：25gSDS，用雙蒸水溶解至250mL。室溫保存10%過硫酸銨(5ml)：0.5 g過硫酸銨溶解于5ml 雙蒸水，可在密封的管內(nèi)，4存放數(shù)月4分離膠緩沖液(100ml):75ml 1.5mol/l Tris-HCl(pH 8.8),4ml 10% S

7、DS,21ml 蒸餾水,可在4存放數(shù)月4堆積膠（濃縮膠）緩沖液(100 ml):50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),4ml 10% SDS,46ml 蒸餾水,可在4存放數(shù)月電泳緩沖液(1L):3g Tris 堿,14.4g 甘氨酸,1g SDS,加蒸餾水至1L,pH 應(yīng)該在8.3左右，在室溫下長期保存5樣品緩沖液(10ml):0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),5ml 50%甘油,2ml 10% SDS,0.5ml 2-巰基乙醇,1ml 1% 溴酚藍,0.9ml 的蒸餾水,可在-20保存數(shù)月考馬斯亮藍染色液(1L)：考馬斯亮藍R-250,1g;甲

8、醇,450ml;蒸餾水,450ml;冰醋酸 100mL.脫色:脫色液(1L)：甲醇,100ml;冰醋酸,100ml;蒸餾水,800ml.2.具體操作步驟：X%分離膠的計算：采用12%的分離膠A液 x/3mlB液 2.5ml蒸餾水 （7.5- x/3）ml10%過硫酸銨 50mlTEMED 5ml總量 10ml灌制分離膠A.將玻璃板洗干凈，烘干或者自然風(fēng)干，裝配好灌膠的模具，關(guān)鍵是確保凝膠玻璃板和墊片的表面緊密接觸，有細微的不匹配就會導(dǎo)致凝膠的滲漏。B.將A液、B液在一個小燒杯中混合，丙烯酰胺是神經(jīng)毒素，操作時必須戴手套。C.加入過硫酸銨和TEMED后，輕輕攪拌使其混勻，凝膠很快會凝固，所以操作

9、要迅速。D.小心將凝膠液用吸管或移液槍沿隔片緩慢加入模具內(nèi)，避免在凝膠內(nèi)產(chǎn)生氣泡。E.當(dāng)加入適量的分離膠溶液時（凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒約0.5cm）,輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層15mm的水層或異丙醇，這使凝膠表面變得平整。F.等待3060min,使凝膠聚合。當(dāng)凝膠聚合后，在分離膠和水層之間會出現(xiàn)一個清洗的界面。聚合好后微微傾斜模具，用吸管或移液槍將水層或異丙醇層吸出，用吸水紙擦干殘留水漬。灌制堆積膠堆積膠經(jīng)常使用5%的濃度，還是以兩塊量為例，成分如下：蒸餾水 2.3mlA液 0.67mlC液 1ml10%過硫酸銨 30ulTEMED 5ul按以下步驟操作：A.將A液、C

10、液和蒸餾水在三角瓶中混勻B.加入過硫酸銨和TEMED,并輕輕攪拌使其混勻C.將堆積膠加到分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端D.將梳子插入凝膠內(nèi)，直至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊。必須確保梳子齒的末端沒有氣泡。E.約30min凝膠聚合，聚合后小心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂。F.將凝膠放入電泳槽中，將電泳緩沖液加到內(nèi)外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。制備樣品和上樣將各種樣品（純化前樣品、過親和柱后樣品、加熱后樣品、0h取樣的樣品、空載質(zhì)粒的樣品）與5樣品緩沖液在一個Eppendorf管中混合，100加熱210min。稍微離心，將樣品加到樣品孔中。將樣品加到加樣孔的底部，并

11、伴隨著染料水平的升高而升高加樣槍頭，避免帶入氣泡。為了避免邊緣效應(yīng)，在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。電泳接通電源，將電壓調(diào)至150200V之間開始電泳，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。結(jié)束后從電泳槽中取出玻璃板，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠。采用考馬斯亮藍染色法考馬斯亮藍染色液：1L考馬斯亮藍R-250 1g甲醇 450ml蒸餾水 450ml冰醋酸 100ml染色過程：將膠置于染色液中，振蕩染色0.51h,有時根據(jù)染色液用過的次數(shù)多少，適當(dāng)延長染色時間。脫色脫色液：1L甲醇 100ml冰醋酸 100ml蒸餾水 800ml棄去染液，將凝膠在水中漂洗幾次，加入脫色液直至背靜干凈，條帶清

12、晰可見。所需藥品與器材：鏈霉素，戊二醛，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸鈉，碳酸氫鈉，氯化鈉，氯化鉀，十二水磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，鹽酸，蒸餾水，丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，Tris，鹽酸，SDS，過硫酸銨,甘氨酸，甘油，2-巰基乙醇，1%溴酚藍，甲醇，冰醋酸，考馬斯亮藍R-250，TEMED燒杯，容量瓶，分光光度掃描儀，透析袋，垂直電泳儀，磁力攪拌器，電子天平，移液管實驗五、純化酶的電泳檢測及比酶活測定1、實驗?zāi)康膶W(xué)會采用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析基因工程產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的純度鑒定及測定酶的比酶活2、實驗原理SDS-PAGE電泳是主要用來測定蛋白質(zhì)分子量大小及純度分析的技術(shù)。如果在

13、PAGE系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，則蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于其分子量的大小，而與蛋白質(zhì)所帶的電荷和形狀無關(guān)。SDS是陰離子去污劑，它能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，并能把大多數(shù)的蛋白質(zhì)分子拆分成亞基形式。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的摩爾比為1.4：1，結(jié)合量很大，因此，加人SDS增加了蛋白質(zhì)表面的負(fù)電荷，屏蔽了沒有SDS時正常存在的任何一種電荷。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，使得雪茄形狀的蛋白質(zhì)分子的軸比發(fā)生改變。在巰基乙醇的作用下，二硫鍵還原為巰基，不同蛋白質(zhì)組成的短軸趨于一致，長軸與分子量成正比。因此，它們的電泳速度不取決于電荷和形狀，僅與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。目前較流

14、行的SDS-PAGE使用的都是線性垂直薄板狀膠，這種膠是指在兩層支持的玻璃板之間形成的薄片狀凝膠。由于薄片膠可在同一膠上跑很多樣品，使聚合、染色脫色具有一致性，所以薄片膠比管狀膠的應(yīng)用更廣泛，本實驗是按照Bio-rad的小凝膠系統(tǒng)來設(shè)計的，這些步驟也適用于其他系統(tǒng)。經(jīng)過親和層析和加熱純化后，重組木聚糖酶應(yīng)該在SDS膠片上顯示出一個單一的條帶，分子量應(yīng)該與預(yù)期的一樣，為40 kDa左右。同一個酶在相同的測定條件下，如果比酶活越高，則表示該酶的純度越大，本實驗中的木聚糖酶經(jīng)過了親和層析和加熱兩步純化后，比酶活應(yīng)該逐漸升高，且經(jīng)過親和層析后和加熱后的比酶活相差不大。3、實驗材料和設(shè)備A. 試劑丙烯酰

15、胺（電泳級）雙丙烯酰胺（N,N-甲叉雙丙烯酰胺）Tris堿SDS (十二烷基磺酸鈉，分析純)TEMED過硫酸銨甘氨酸B. 工作液：A液: 丙烯酰胺儲存液，100ml 30% (w/v) 丙烯酰胺，0.8% (w/v)雙丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一種皮膚刺激物和神經(jīng)毒劑，操作時必須戴手套29.2 g丙烯酰胺0.8 g 雙丙烯酰胺加蒸餾水溶至100 ml，棕色瓶4保存B液：4分離膠緩沖液，100ml75ml 2 mol/l Tris-HCl(pH 8.8)4ml 10% SDS21ml 蒸餾水可在4存放數(shù)月C液：4堆積膠（濃縮膠）緩沖液，100 ml50ml 1mol/l Tris-HCl(

16、pH 6.8)4ml 10% SDS46ml 蒸餾水可在4存放數(shù)月10%過硫酸銨，5ml0.5 g過硫酸銨5ml 蒸餾水可在密封的管內(nèi)，4存放數(shù)月電泳緩沖液：1L3g Tris 堿14.4g 甘氨酸1g SDS加蒸餾水至1LpH 應(yīng)該在8.3左右，在室溫下長期保存5樣品緩沖液，10ml0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)5ml 50%甘油2ml 10% SDS0.5ml 2-巰基乙醇1ml 1% 溴酚藍0.9ml 的蒸餾水可在-20保存數(shù)月C. 實驗設(shè)備蛋白質(zhì)電泳裝置（垂直板蛋白電泳儀和電源）電源(電壓200V，電流500mA)100沸水浴移液槍搖床1.5 mL小所料管

17、4、實驗步驟待檢測的蛋白質(zhì)分子量的大小決定了所使用的分離膠的濃度，下面為不同濃度的分離膠的分離范圍：丙烯酰胺在凝膠中的百分比 分離膠的范圍 15% 1545kDa 12.5% 1560kDa 10% 1875kDa 7.5% 30120kDa 5% 60212kDa制膠所需時間：制分離膠 60min制堆積膠 30min上樣 15min電泳 45min染色（考馬斯亮藍染色） 1h完全脫色 812hX%分離膠的計算：A液 x/3mlB液 2.5ml蒸餾水 （7.5- x/3）ml10%過硫酸銨 50mlTEMED 5ml總量 10ml灌制分離膠A.將玻璃板洗干凈，烘干或者自然風(fēng)干，裝配好灌膠的模具

18、，關(guān)鍵是確保凝膠玻璃板和墊片的表面緊密接觸，有細微的不匹配就會導(dǎo)致凝膠的滲漏。B.將A液、B液在一個小燒杯中混合，丙烯酰胺是神經(jīng)毒素，操作時必須戴手套。C.加入過硫酸銨和TEMED后，輕輕攪拌使其混勻，凝膠很快會凝固，所以操作要迅速。D.小心將凝膠液用吸管或移液槍沿隔片緩慢加入模具內(nèi)，避免在凝膠內(nèi)產(chǎn)生氣泡。E.當(dāng)加入適量的分離膠溶液時（凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒約0.5cm）,輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層15mm的水層或異丙醇，這使凝膠表面變得平整。F.等待3060min,使凝膠聚合。當(dāng)凝膠聚合后，在分離膠和水層之間會出現(xiàn)一個清洗的界面。聚合好后微微傾斜模具，用吸管或移液槍將水層或異丙醇層吸出，用吸水紙擦干殘留水漬。灌制堆積膠堆積膠經(jīng)常使用5%的濃度，還是以兩塊量為例，成分如下：蒸餾水 2.3mlA液 0.67mlC液 1ml10%過硫酸銨 30mlTEMED 5ml按以下步驟操作：A.將A液、C液和蒸餾水在三角瓶中混勻B.加入過硫酸銨和TEMED,并輕輕攪拌使其混勻C.將堆積膠加到分離膠的上