九龍江大腸菌群數(shù)測定

1、九龍江水大腸菌群的測定周曉芬（漳州師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系食品科學(xué)與工程 091304201）【摘要】水中細(xì)菌菌落總數(shù)可作為判斷被檢水樣被有機(jī)物污染程度的指標(biāo)。細(xì)菌數(shù)量越多，則水中有機(jī)質(zhì)含量越高。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用多管發(fā)酵法測定水中細(xì)菌總數(shù)。再用革蘭氏染色法鑒定細(xì)菌的種類。從而得出九龍江水中大腸菌群的近似值?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)菌 菌落 大腸菌群 多管發(fā)酵法 革蘭氏染色法前言：廣義的細(xì)菌即為原核生物是指一大類細(xì)胞核無核膜包裹，只存在稱作擬核區(qū) (或擬核)的裸露DNA的原始單細(xì)胞生物，包括真細(xì)菌和古生菌兩大類群。人們通常所說的即為狹義的細(xì)菌，狹義的細(xì)菌為原核微生物的一類，是一類形狀細(xì)短，結(jié)構(gòu)簡單，多以二分裂方式

2、進(jìn)行繁殖的原核生物，是在自然界分布最廣、個(gè)體數(shù)量最多的有機(jī)體，是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。菌落是由單個(gè)細(xì)菌（或其他微生物）細(xì)胞或一堆同種細(xì)胞在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度；形成肉眼可見有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)等特征的子細(xì)胞的群落。大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌?？偞竽c菌群可用多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法檢驗(yàn)。多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群細(xì)菌能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢

3、，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個(gè)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果以最可能數(shù)（most probable number），簡稱MPN表示。1 材料與方法1.1初步發(fā)酵試驗(yàn) 試驗(yàn)材料與用具器材：試管、吸頭（1ml、5ml）、冰箱、量筒、玻棒、燒杯、PH計(jì)、培養(yǎng)皿、水浴鍋（箱）、培養(yǎng)箱、試劑瓶、電磁爐、顯微鏡、錐形瓶、接種環(huán)、干燥箱、漢德氏管、高壓滅菌器、單道移液器、電子分析天平培養(yǎng)基：乳糖膽鹽蛋白胨 ， 伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）操作步驟（一）多管發(fā)酵（大腸菌群的測定）1、水樣的采集：用高溫滅菌過的試劑瓶到九龍江取水，將瓶子連瓶蓋一起伸到10-15厘米的深處打開瓶塞，等水滿后蓋上蓋子后從水中

4、取出。運(yùn)送水樣時(shí)應(yīng)避免玻璃瓶搖動(dòng)，水樣溢出后又流回瓶中，從而增加污染。 2、水樣的稀釋：將滅菌的三根試管各裝4.5ml的無菌水標(biāo)上1、2、3的記號。充分振蕩水樣，從中吸取1ml于0.5號試管中，充分振蕩即得1：1 0的稀釋 液。同理配制1：100及1：1000稀釋液。3、水源水的檢查 （1）初步發(fā)酵試驗(yàn) 在1個(gè)含有50ml 三倍濃縮的乳糖膽鹽蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，加入100ml 水樣（輕度污染水的測定）。在1支含有5ml 三倍濃縮乳糖膽鹽蛋白胨發(fā)酵管中，各加入10ml 水樣（中、輕度污染水的測定各一支）。（2）從原水樣、1:10、1:100、的稀釋液各吸取1ml于4支經(jīng)過滅菌的裝有10ml普通濃度

5、乳糖蛋白胨中。（每吸取一次，吸頭都要換一次。）原水樣，1:10重復(fù)一次（中、輕度污染水的測定各一支）。（3）將上述溶液混勻后，于36攝氏度培養(yǎng)24h，24h未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48h。記錄其稀釋液的產(chǎn)氣管數(shù)，進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。（4）平板分離經(jīng)24h 培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48h 產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，再于37下培養(yǎng)18-24h，將符合下列特征的菌落的一小部分，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。（5）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖膽鹽蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1-3個(gè)，3

6、7培養(yǎng)24h，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實(shí)有大腸菌群存在。證實(shí)有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗(yàn)的陽性管（瓶）數(shù)查表，即得大腸菌群數(shù)。表1：大腸菌群檢數(shù)表(嚴(yán)重污染水)接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數(shù)備注10.10.010.001238000表2：大腸菌群檢數(shù)表(中度污染水)接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數(shù)備注1010.10.0180接種水樣量為11.11(10,1,0.1,0.01個(gè)一份)+80+80+85+170+180+210+220+270+920+940+1700+2300+9500+23800+23800表3：大腸菌群檢數(shù)表(輕度污染水)接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數(shù)備注

7、1001010.18接種水樣量為11.11(10,1,0.1,0.01個(gè)一份)+8+8+8.5+17+18+21+22+27+92+94+170+230+950+2380+2380附錄：1.乳糖膽鹽蛋白胨液體培養(yǎng)基乳糖 30g 蛋白胨 60g 0.04%溴甲酚紫水溶液 75mL膽鹽 15g蒸餾水 1000mL將上述培養(yǎng)基成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中后，調(diào)pH7.27.4，加入0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，充分混勻，分裝于置有杜漢氏小管的試管內(nèi)。115滅菌15min。2.三倍濃縮乳糖膽鹽蛋白胨液體培養(yǎng)基（多管發(fā)酵法檢測大腸菌群）體積不變（1000 mL），其各成分量為“1”配方中的3倍

8、。1.2 革蘭氏染色法 試驗(yàn)材料與用具1.菌種 大腸桿菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，蠟樣芽孢桿菌（B.cereus)1224h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.染色劑：革蘭氏染色液。3.儀器及其他用具：顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙、生理鹽水等操作步驟：1. 制片（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片中間加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，制成很薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：讓涂片在酒精燈火焰上方文火烘干。（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）注意：要用活躍生產(chǎn)期的幼培養(yǎng)物做革蘭

9、氏染色；涂片用的載玻片要潔凈無油污跡，否則影響涂片。挑菌量應(yīng)少些，涂片宜薄，過厚重疊的菌體則不易觀察清楚。2. 初染（1）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于干凈的培養(yǎng)皿上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1-2分鐘。（2）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。3. 媒染（1）用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1分鐘。（2）水洗：用水洗去碘液。4.脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗。革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭氏陽性細(xì)菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性細(xì)菌。而脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性細(xì)菌則會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭

10、氏陽性細(xì)菌。脫色時(shí)間的長短還受涂片的厚薄、脫色時(shí)玻片晃動(dòng)的程度等因素的影響。脫色時(shí)間一般約20-30s。5. 復(fù)染（1）用番紅復(fù)染約2分鐘。（2）水洗：用水洗去涂片上的番紅染色液。（3）晾干：將染好的涂片用吸水紙吸干。6鏡檢鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的是革蘭氏陰性菌。2.結(jié)果與分析經(jīng)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，有4只發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在平板分離實(shí)驗(yàn)后，在培養(yǎng)基里培養(yǎng)一段時(shí)間，有100ml、10ml、1ml、0.1ml的平板上長出了深紫色且有金屬光澤的菌落。將EMB平板劃線的陽性菌落進(jìn)行革蘭氏染色，均顯示革蘭氏陰性，再經(jīng)復(fù)發(fā)酵之后，結(jié)果均為陽性。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果對照大腸桿菌群檢數(shù)表，可知九龍江水為輕度污染。3.總結(jié)與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出以下結(jié)論：（1） 革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。（2） 造成大腸桿菌含量高的主要原因是附近居民的生活污水排往江里，并且伴隨有周圍工廠污水的注入，建議周圍居民需更加保護(hù)好水源。（3） 發(fā)酵管沒有全都產(chǎn)酸產(chǎn)氣可能的原因是：水樣的濃度太