反相高效液相色譜法測(cè)定藏藥材紅毛五加中金絲桃苷的含量(一)

1、反相高效液相色譜法測(cè)定藏藥材紅毛五加中金絲桃苷的含量(一)    作者：李瑩袁瑋劉超劉圓【摘要】 目的建立藏藥材紅毛五加藥材中金絲桃苷的含量測(cè)定方法并比較其不同藥用部位及不同產(chǎn)地、不同采收期的紅毛五加皮中金絲桃苷的含量。方法Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 m）,柱溫30，流動(dòng)相甲醇（A）-0.5 %磷酸水溶液（B）,梯度洗脫，程序?yàn)椋夯€（AB=3070）,05 min(AB=3565),515 min(AB=4060),1530 min（AB=5050）；檢測(cè)波長(zhǎng) 358 nm,流速1 ml·min-1

2、。結(jié)果金絲桃苷在2.90×10-30.58 g范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量具有良好的線性關(guān)系,回歸方程 Y =4×106X-14 065，r=0.999 9(n=9)，平均回收率為100.6 %，RSD為0.96 %（n=6）。結(jié)論該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,有助于紅毛五加質(zhì)量控制方法的研究。 【關(guān)鍵詞】 紅毛五加；金絲桃苷；反相高效液相色譜Abstract：ObjectiveTo develop an RP-HPLC method for determination of Hyperoside in Acanthopanax giraldii Harms, and to deter

3、mine the contents of Hyperoside in different parts, different areas and different collection time of Acanthopanax giraldii Harms. MethodsThe analysis was carried out at 30 on a Kromasil C18 column eluted with a mobile phase consisted of methanol(A)-0.5 phosphoric acid(B). The gradient elution was as

4、 following: The ratio of A and B was 35/65 from 0 to 5 min. ii The ratio of A and B was 40/60 from 5 to 15 min. The ratio of A and B was 50/50 from 15 to 30 min.The detective wavelength was at 358 nm with the flow rate of 1.0 ml/min. ResultsThe calibration curve was linear within the concentration r

5、ange of 2.90×10-30.58 g with r of 0.999 9(n=9).The average recovery was 100.6% and RSD was 0.96% (n=6）.ConclusionThis method is simple, accurate and reproducible. It is useful for quality control of Acanthopanax giraldii Harms.Key words：Acanthopanax giraldii Harms ; Hyperoside ; RP-HPLC藏藥材紅毛五加為

6、五加科五加屬植物Acanthopanax giraldii Harms的干燥莖皮。中國(guó)藥典尚未收載紅毛五加藥材。在文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)刺五加中含有金絲桃苷成分1，金絲桃苷對(duì)鈣內(nèi)流有較強(qiáng)的選擇性阻滯作用，并對(duì)心肌有保護(hù)作用，對(duì)腦缺血損傷也有保護(hù)作用，調(diào)節(jié)免疫作用，臨床上主要用于治療心腦血管疾病、抗菌、抗炎、止咳、平喘、祛痰等，且療效突出，應(yīng)用前景十分廣闊2，這與紅毛五加皮的對(duì)心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用3相一致。紅毛五加與刺五加為同科同屬植物，目前作者尚未查閱到紅毛五加中有關(guān)金絲桃苷的研究。四川為紅毛五加藥材的主要產(chǎn)區(qū)，其傳統(tǒng)的入藥部位為莖皮，本課題組的前期研究表明其莖皮中其它

7、有效成分的含量較高48。本實(shí)驗(yàn)擬采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法考察比較紅毛五加不同藥用部位、不同產(chǎn)地和不同采收期的紅毛五加皮中金絲桃苷的含量，以期為紅毛五加藥材的質(zhì)量控制、最佳采收期的確定、資源的合理利用提供參考。1 儀器與材料Waters2695高效液相色譜儀，Waters2996檢測(cè)器,Empower色譜工作站。金絲桃苷（批號(hào)111521-200303，中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量測(cè)定用）；甲醇為色譜純；水為二次重蒸水；其余試劑均為分析純。9個(gè)不同產(chǎn)地的紅毛五加藥材樣品采自四川省境內(nèi)，經(jīng)劉圓教授鑒定為五加科五加屬植物Acanthopanax giraldii Harms的干燥莖皮

8、。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件Krosmasil C18柱（250 mm×4.6 mm,5 m），柱溫30。流動(dòng)相為甲醇（A）-0.5 %磷酸水溶液（B）,梯度洗脫，程序?yàn)椋夯€（AB=3070）,05 min(AB=3565),515 min(AB=4060),1530 min（AB=5050）；檢測(cè)波長(zhǎng)358 nm,流速1 ml·min-1。金絲桃苷峰可以達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，分離度好，按照金絲桃苷峰計(jì)，理論塔板數(shù)不應(yīng)低于5 000，對(duì)照品溶液及紅毛五加樣品溶液的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。2.2 溶液的制備2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取金絲桃苷對(duì)照品適量，加甲醇配

9、置成29.00 g·ml-1的溶液。2.2.2 樣品溶液的制備稱取紅毛五加藥材粉末（過(guò)40目篩）約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中加入石油醚溶液25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，取出，過(guò)濾，棄去濾液，揮去溶劑，濾渣中加入25 ml甲醇，稱定重量，回流2 h，取出，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 m的微孔濾膜，作為樣品溶液。2.3 線性關(guān)系的考察分別精密量取上述對(duì)照品溶液0.1，0.5，1，2，4，6，10，20 l，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（g）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y =4×106X-14 065，

10、r=0.999 9(n=9)。結(jié)果表明金絲桃苷在2.90×10-30.58 g范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量具有良好的線性關(guān)系。2.4 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10 l，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的RSD為0.96 %（n=6）。結(jié)果表明儀器精密度良好。2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密量取樣品溶液10 l，分別于0，2，4，6，8 h測(cè)定。按照金絲桃苷對(duì)照品峰面積計(jì)算RSD為0.57%（n=6）。結(jié)果表明樣品溶液在配制后8 h內(nèi)穩(wěn)定。2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取紅毛五加皮樣品約2 g，精密稱取6份 ,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定金絲桃苷的含量。結(jié)果樣品中金絲桃苷的量均值

11、為99.68 g/g，RSD為1.12%（n=6）,表明重復(fù)性良好。2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取9份已知含金絲桃苷量的藥材粉末2.0 g，依次加入低、中、高3種質(zhì)量濃度金絲桃苷對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果平均回收率為100.6%，RSD為0.96%（n=9）。2.8 樣品測(cè)定精密稱取紅毛五加的不同藥用部位及不同產(chǎn)地、不同采收期的紅毛五加皮（過(guò)40目篩）2 g。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表13，色譜圖見(jiàn)圖1。表1 紅毛五加不同部位金絲桃苷的含量（略）表2 不同產(chǎn)地紅毛五加皮中金絲桃苷的含

12、量（略）表3 不同采收期紅毛五加皮中金絲桃苷的含量（略）從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，紅毛五加各部位中葉中金絲桃苷的含量最高: 645.31 g/g；四川阿壩茂縣的紅毛五加皮中金絲桃苷含量明顯高于其他產(chǎn)地，為179.42 g/g；6月份的紅毛五加皮中金絲桃苷含量最高，為112.03 g/g。3 討論3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇以流動(dòng)相作溶劑，在200400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定了金絲桃苷對(duì)照品的紫外光譜圖，結(jié)果在256 nm 和358 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，確定358 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。3.2 提取方法的選擇實(shí)驗(yàn)中曾分別考察了用甲醇作為提取溶劑超聲0.5 h9，超聲1 h10，醋酸乙酯索氏提取11以及石油醚先脫脂，再

13、加甲醇回流的提取方法12等4種方法測(cè)定同批試樣的含量，經(jīng)比較最后一種方法提取的最為完全，故采用石油醚先脫脂，再加甲醇回流的提取方法。3.3 流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)曾考察了乙腈-0.05 %磷酸水溶液（1684）13、甲醇-0.1%磷酸溶液（4060）10、甲醇0.2 %磷酸溶液（4555）14為流動(dòng)相，金絲桃苷的保留時(shí)間相對(duì)短些，但不能與其它化合物很好地分離。采用本文選擇的梯度洗脫，可以達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，分離度好。3.4 不同入藥部位藥效成分含量從入藥部位來(lái)看，藏藥材紅毛五加的葉中金絲桃苷的含量最高，明顯高于紅毛五加皮中金絲桃苷的含量，與結(jié)合本課題組的前期研究成果相一致15，但是紅毛五加葉能否

14、同等入藥，還需要進(jìn)行更多化學(xué)成分分析和藥理實(shí)驗(yàn)研究。3.5 不同產(chǎn)地或采收期藥效成分含量從不同產(chǎn)地來(lái)看，采自四川阿壩藏族羌族自治州茂縣的紅毛五加皮中金絲桃苷含量明顯高于其它產(chǎn)地。從不同采收期來(lái)看，6月份的紅毛五加皮中金絲桃苷含量最高。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，紅毛五加藥材中金絲桃苷的含量除葉以外，其它含量值均低于0.05%，但仍為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。【參考文獻(xiàn)】1曹建國(guó)，趙則海，楊逢建，等.刺五加葉中金絲桃苷含量的測(cè)定J.植物學(xué)通報(bào)，2005，22(2)：203.2李艷，曹學(xué)麗，付鵬，等.貫葉金絲桃活性成分及其分離純化與檢測(cè)方法的研究進(jìn)展J.藥學(xué)進(jìn)展，2007,32(1):15.3王祝偉，孫

15、毓慶紅毛五加藥理作用研究進(jìn)展J.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003,20(1) :65.4孟慶艷，劉圓，任朝琴RP-HPLC法測(cè)定川產(chǎn)藏藥材紅毛五加不同藥用部位中腺苷的含量C第67屆世界藥學(xué)大會(huì)論文集，2007：212.5劉圓，孟慶艷，彭鐮心，等川產(chǎn)藏藥材不同產(chǎn)地紅毛五加多糖含量的比較J中草藥，2007，38（2）：283.6劉圓，孟慶艷，任朝琴高效液相色譜法比較川產(chǎn)藏藥材紅毛五加不同藥用部位中腺苷的含量J中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，43（18）：1429.7劉圓，孟慶艷，任朝琴RP-HPLC法測(cè)定川產(chǎn)藏藥不同產(chǎn)地紅毛五加莖皮中腺苷的含量J藥物分析雜志，2007，27（10）：69.8劉圓，孟慶艷，孫卓然，等 RP-HPLC法測(cè)定藏藥材紅毛五加不同產(chǎn)地中綠原酸的含量J中國(guó)中藥雜志，2007，32（8）：1585.9許干麗，茅向軍，熊慧林，等HPLC法測(cè)定野生及人工栽培貫葉連翹中金絲桃苷的含量J中國(guó)中藥雜志，2003，28（8）：784.10張俊松，王曉利，羅 謙，等HPLC測(cè)定貫葉連翹及提取物中偽金絲桃素和金絲桃苷的含量J中成藥，2006，28（5）：709.11石娟，劉瑞，宋曉濤，等HPLC測(cè)定不同種鹿銜草中金絲桃苷