臨床樣本DNA模板的常規(guī)制備方法

1、臨床樣本 DNA 模板的常規(guī)制備方法、病毒標(biāo)本中提取 DNA(支原體、腺病毒)處理方法(1 )將擦拭過(guò)的咽拭紙放入1.5ml 裝有 1ml 生理鹽水的 eppendorf 管中(2 )以 10,000r/min 離心 5 分鐘，去上清液。(3 )沉淀物加入 30 ml TE液混勻后煮沸 10 分鐘，4 C 保存?zhèn)溆?。二、從?xì)菌中提取 DNA1 . NG (淋球菌)DNA 的提取 標(biāo)本可取自尿道、生殖道或結(jié)膜分泌物(1 )取男性尿道口或女性宮頸處分泌物于事先加有1ml 生理鹽水的 eppendorf 管內(nèi)(2 )振蕩棉簽或拭紙使 NG 釋放出來(lái)。(8 )加入 2 倍體積無(wú)水乙醇沉淀 DNA。(9

2、 )去乙醇，空氣干燥后加入30 卩l(xiāng)的 TE 液，置 4C冰箱保存?zhèn)溆谩? . TB (結(jié)核桿菌)DNA 的提取臨床標(biāo)本可來(lái)源于痰、 尿、支氣管灌洗液、胸水、腹水、心包積液等。處理方法也不盡相同，除痰標(biāo)本外,其他標(biāo)本大致相同。注意痰標(biāo)本的留取一定要取次日早上的晨痰，留存器皿要無(wú)菌消毒，避免污染。(1 )痰標(biāo)本 TB DNA 的提取1挑少許痰液放入 1.5ml 的 eppendorf 管中，加入 5mo1/L NaOH 500gl混勻，使痰液變稀，室溫中搖動(dòng) 20 分鐘。2加入 1mo1/L NaH2PO4600gl混勻(起中和作用)，10,000r/min 離心 5 分鐘。3去上清液，補(bǔ)加 T

3、E 至 500gl混勻，加少許溶菌酶。4置 37C消化 30 分鐘。5加等體積的酚、氯仿、異戊醇(25 : 24 : 1 )混合液，搖勻 20 分鐘。610,000r/min 離心 5 分鐘，將上清液移至另一干凈eppendorf 管中，加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液，繼續(xù)搖勻 20 分鐘。710,000r/min 離心 5 分鐘，移上清液于另一小管中，加入等體積異丙醇搖勻。810,000r/min 離心 5 分鐘，去上清液，置空氣中干燥，加入 30glTE 溶解沉淀物，置 4C冰箱備用。(2 )胸水、腹水、支氣管灌洗液、尿液、心包積液標(biāo)本TB DNA 的提取1將上述液體 3ml ，經(jīng)反復(fù)

4、離心，去上清液，留沉淀物。2按上述痰標(biāo)本處理操作步驟-提取。三、組織內(nèi)基因 DNA 的提取1 . HPV (尖銳濕疣)提取(1 )取綠豆大小的組織樣品于 1.5ml 的 eppendorf 管中，加入細(xì)胞裂解液少許，裂解液含 0.1mo1/LNaC1、0.2mol/L 蔗糖、0.01 mol/L EDTA 、0.3mol/L tris( pH8.0 )和 0.5%-1% SDS(2 )用眼科剪剪碎組織(越細(xì)越好)，補(bǔ)足裂解液至400gl，并攪散組織塊。(3 )置 60C65C水浴消化 2-3 小時(shí)，中間搖勻兩次。(4 )加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液抽提，搖勻20 分鐘。(5 ) 10,0

5、00r/min 離心 5 分鐘，上清液移入新的eppendorf管中，用兩倍體積的乙醇沉淀DNA(6)10,000r/min 離心 5 分鐘，去上清液，空氣干燥沉淀物，加入30 卩l(xiāng)的 TE，置 4 C 保存?zhèn)溆谩? 各種腫瘤組織提取(胃、腸、心肌、骨骼肌、肝、腺癌、子宮、絨毛等)(1 )取綠豆大小的組織樣品于1.5ml 的 eppendorf 管中，加入細(xì)胞裂解液少許，每10ml 裂解液含有：1 mol/L Tris-HCI 0.1ml0.5mol/L EDTA 2ml5 mol/L NaC1 0.2ml20% SDS 1ml200 卩 g/卩蛋白酶 K 1ml1 mol/L DTT 0.3

6、9ml(2 )用眼科剪盡量剪細(xì)組織塊，補(bǔ)加細(xì)胞裂解液至500gl o(3 ) 55C66C保溫 23 小時(shí)，中間搖勻兩次。(4 )加入等休積的酚、氯仿、異戊醇混合液搖勻20 分鐘，10,000r/min 離心 5 分鐘。(5 )上清液移入新的 eppendorf管中，加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液繼續(xù)搖勻20 分鐘，10,000r/min離心 5 分鐘。(6 )上清液移入新的 eppendorf 管中，加入 2 倍體積無(wú)水乙醇沉淀 DNA。(7 )挑出 DNA，用 70% 乙醇洗兩次，空氣干燥，加適量 TE 溶解 DNA (根據(jù) DNA 量決定加入 TE 量)，置 4C保存?zhèn)溆?。四、血?biāo)本

7、 DNA 的提取方法一：(1 )取抗凝外周血 50 卩l(xiāng)，加入 6mol/L ，NaI 50 卩l(xiāng)，混勻，振蕩 30 秒。(2 )加等體積的氯仿、異戊醇混合液，振蕩30 秒。(3 ) 10,00012,000r/min離心 25 分鐘。(4 )取上清液移至新的 eppendorf管中，加入異丙醇 80gl混勻，至沉淀產(chǎn)生。(5 ) 12,000r/min 離心 3 分鐘，去掉異丙醇，37% 異丙醇再洗一次，離心，去上清液，沉淀物干燥 后(放室溫)，加入 30 卩l(xiāng)無(wú)菌水溶解，置 4C保存?zhèn)溆谩７椒ǘ?1 )取 10ml 外周血，放于 50ml 管中，按 1.3:10 加入 ACD 抗凝。(2

8、 ) 4,000r/min 離心 10 分鐘，去上清液。(3 )加 1.7%NH4CI 至 50ml ，混勻，放 37C保溫 45 分鐘。(4 ) 4,000r/min 離心 10 分鐘，去上清液。(5 )加入 50ml PBS 液混勻，4,000r/min 離心 10 分鐘。(6 )去上清液，沉淀物中補(bǔ)加TE 液至 10ml ，充分混勻。(7 )加入 2.5ml 5mol/L NaClO4,混勻，力口 3ml 10% 的 SDS 混勻。(8 )置 55C60C保溫 23 小時(shí)。(9 )加入等體積的酚、氯仿、異戊醇(25 : 24 : 1 )混合液搖勻 40 分鐘。(10)4,000r/min

9、 離心 10 分鐘，輕輕將上清液移入新的eppendorf 管中。(11 )用 2 倍體積無(wú)水乙醇沉淀 DNA，輕搖，挑出懸浮 DNA 放入新管中。(12 )加入 5 ml 的 TE 液，溶解后加 50gl RNA 酶(20mg/ml)。(13 )置 37C溫箱中保溫 1 小時(shí)，加 50 卩 1 10%SDS 、100gl 20mg/ml 的蛋白酶 K、120 卩 1 0.5mol/L 的 EDTA 混勻，37C過(guò)夜。(14 )加 5ml TE 液，混勻后加 10ml 酚、氯仿、異戊醇(25 : 24 : 1 )混合液，混勻，放置 40 分 鐘。(15 ) 4,000r/min 離心 10 分

10、鐘，去上清液，加入 2 倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀DNA，挑出 DNA 用75%乙醇洗兩次。(16 )空氣干燥后，加入適量 TE 溶解 DNA，置 4C備用。人最終要尋找的，就是最愛(ài)的那個(gè)自己。只是這個(gè)自己，有人終其一生也未找到；有人只揭開(kāi)了冰山的一角，有人有幸會(huì)晤一次，卻已用盡一生。人生最難抵達(dá)的其實(shí)就是自己。古希臘哲學(xué)大師亞里士多德說(shuō)：人有兩種，一種即 吃飯是為了活著”一種是 活著是為了吃飯”一個(gè)人之所以偉大，首先是因?yàn)樗谐诔Ｈ说男摹Ｖ井?dāng)存高遠(yuǎn)”風(fēng)物長(zhǎng)宜放眼量”這些古語(yǔ)皆鼓舞人們要樹(shù)立雄無(wú)數(shù)個(gè)自己，萬(wàn)千種模樣，萬(wàn)千愫情懷。有的和你心手相牽，有的和你對(duì)抗，有的給你雪中送炭，有的給你煩憂與其說(shuō)

11、人的一生是同命運(yùn)抗?fàn)?，與性格妥協(xié)，不如說(shuō)是與自己抗?fàn)?，與自己妥協(xié)。我不敢恭維我所有的自己都是美好的，因?yàn)榭傆袀€(gè)對(duì)抗的聲音：你還沒(méi)有這樣的底氣。”很慚愧，坦白說(shuō)，自己就是這個(gè)樣子：卑微過(guò)，像一棵草，像一只蟻，甚至像一粒土塊，但拒絕猥瑣！懦弱過(guò)，像掉落下來(lái)的果實(shí)，被人撣掉的灰塵，但拒絕屈膝，寧可以卵擊石，以渺 小決戰(zhàn)強(qiáng)大。自私過(guò)，比如遇到喜歡的人或物，也想不擇手段，據(jù)為己有。貪婪過(guò)，比如面對(duì)名利、金錢(qián)、豪宅名車(chē)，風(fēng)花雪月，也會(huì)心旌搖搖，浮想聯(lián)翩。倔強(qiáng)過(guò)，比如面對(duì)誤解、輕蔑，有淚也待到無(wú)人處再流，有委屈也不訴說(shuō)，不申辯，直到做好，給自己證明，給自己看！溫柔過(guò)，當(dāng)愛(ài)如春風(fēng)襲來(lái)，當(dāng)情如花朵芳醇，黃昏月下，你儂我儂。強(qiáng)大過(guò)，內(nèi)剛外柔，和風(fēng)雨搏擊，和坎坷宣戰(zhàn)，不失初心，不忘夢(mèng)想，雖敗猶榮。這樣的自己一個(gè)個(gè)站到鏡中來(lái)，千面萬(wàn)孔。有的隱著，有的浮著，有的張揚(yáng)，有的壓抑，有的狂狷，有的沉寂，有的暴躁，有的溫良庸俗的自己，逐流的自己，又兼點(diǎn)若仙的自己，美的自己，丑的自己，千篇一律的自己，獨(dú)一無(wú)二的自己。我們總想尋一座廟宇，來(lái)安放塵世的疲憊，尋一種宗教，來(lái)稀釋靈魂里的荒涼。到頭來(lái)，卻發(fā)現(xiàn)，苦苦向往的湖光山色，原來(lái)一直在自己的心里，我就是自己的廟宇，我就是自己的信仰。 渺小如己，偉大如己！王是自己，囚是自己。廟堂是自己，