PCR技術(shù)檢測種傳植病細菌研究進展

1、PCR 技術(shù)檢測種傳植病細菌研究進展 ¹張 卉 1、 2趙廷昌 1李景富 2孫福在 1劉學(xué)敏 2回文廣 1張濤濤 3(11中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室 北京 10009421東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 31北京市農(nóng)林科學(xué)院植保環(huán)保研究所 摘要 本文綜述了 PCR 技術(shù)在種傳植病細菌檢測方面近年來的研究進展狀況 , 對各種檢 測方法進行了比較詳細的介紹 , 著重闡述了種類 、 原理 、 靈敏度等方面的研究進展 。關(guān)鍵詞 PCR 種傳病害 細菌 檢測種傳病害為通過種子攜帶傳播的一類植 物病害 1。病原 體可以 存在于 用于 播種材 料的表面、 內(nèi)部或內(nèi)外兼存 , 有的則

2、以病原體 直接混在種子之間。地 球上 90%左右的食用作 物是以種子 繁殖的 , 這些 作物均受 種傳病害 的侵害 2。 種帶病原是很多農(nóng)作物病害的重要初侵染源 之一 , 是引起作物在田間和在貯藏期發(fā)病的 禍根。種子攜帶并傳播病害是很多地區(qū)發(fā)生 新病害的原因。種傳細菌性病害有 74種以 上 3, 理論上任何植物病原細菌都有可能由 種子 傳 播。 菜 豆 暈 疫 病 (Pseudomonas sy-r ingae pv. phaseolicola , 116萬粒種子中若 有一粒帶菌則可使菜豆暈疫病發(fā)生流行造成 生 產(chǎn) 上的損失 4、 5。因此 , 加強種 子檢測以 減少、 減輕病害的發(fā)生是十分重

3、要的。下面 對 PCR 技術(shù)在種傳細菌檢測方面進行較為 詳細介紹。1PC R 技術(shù)在種傳細菌檢測中的應(yīng)用 M ullis 等 6在 1985年創(chuàng)立的 PCR 方法 已成為分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的經(jīng)典試驗 方法。此法靈敏、 準確、 方便、 快速 , 可在短時 間內(nèi)擴增 出數(shù) 百萬 個特 異 DNA 序列 的拷 貝 , 目前研究人員已在檢測種子帶菌方面應(yīng) 用 PCR 技術(shù)做了大量工作 , 設(shè)計得到了大量 相關(guān)引物。例如 , 用于檢測菜豆暈疫病的引 物 7, 檢測番茄細菌性潰瘍病 (CMM 的引物 等。多種以 PCR 為基礎(chǔ)的分析 方法 , 比如 , 以 rDNA 為模 板 的 PCR:ITS -P

4、CR 、 tRNA -PCR 等都已經(jīng)出現(xiàn) , 利用特異引物的新方法 使細 菌 性 病害 檢 測 能 力 得 到 加 強。根 據(jù) PCR 所擴增模板特點將 PCR 檢測方法分類 如下。111用特定基因和 DNA 序列鑒定病害 11111以致病性基因做目的片段使用特異引物 PCR 擴增與已知細菌致 病性相關(guān)的片段來檢測和鑒定病害是很有效 的。例如 , 土壤桿菌屬細菌 (Agrobacter ium 含有的染色體基因很復(fù)雜 , 可誘發(fā)很多病害 , 這些病害的明顯癥狀是由根瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒或根 誘導(dǎo)質(zhì)粒的存在引起的。測得這些質(zhì)?；?序列 , 再找到相應(yīng)引物進行擴增得到特異片 段 , 達到檢測目的。 H

5、aas 等以高度保守的毒 性 D2基因的 內(nèi)切核酸酶編碼區(qū) 設(shè)計引物 , 特異性地檢測 Agr obacter ium 病原菌系。有 的引物可以用來擴增出編碼果膠酶的 434bp 的片 段 , 這 一 片 段 與 軟 腐 病 菌 (Erw inia carotovora 引起的軟 腐病相 關(guān)。有 的引物¹北京市自然科學(xué)基金 (6012017 、 國家 863(2001AA249051 和十五攻關(guān)資助項目 收稿日期 :2002-11-07, 2003-03-21修回甚至根據(jù)控制果膠酶基因的不同序列可專一 性鑒定亞種。包括黑腐變種 (E. carotovor a pv. atr osep

6、 tia 、軟 腐 亞 種 (E. carotovor a subsp. carotovora 、山俞菜亞 種 (E. caro -tovora subsp. w asabiae , 但不包括其它歐氏 桿菌 (Erwinia 種。還有的引物可以檢測出 馬鈴 薯軟腐 病病原 菌 (E. chrysanthem i 。 目前 , 乙烯形成酶 (efe 基因 8, 冠毒素生物 合成基因 9都已被用作目 的基因來 檢測病 害。11112無特性 DNA (Anonymous -DNA 作 為擴增目標無特性 DNA 序列也可被用于設(shè)計 PCR 引物。經(jīng)?？梢杂媚骋晃锓N 中特有的 DNA 片段作為目標片段將

7、其專一性地鑒定出來 , 這樣的 DNA 片 段序 列就 可以 用 于設(shè) 計專 一、 靈敏的 PCR 基礎(chǔ)上的檢測方案。這樣的 無特性 DNA 包括克隆的 RAPD 片段、 克隆 的 rep -PCR 片段、 負雜交片段、 插入元素和無 特性探針。但是這種目標序列對用于長期檢 測可能不理想 , 因為對無特性目標序列的可 變性 , 穩(wěn)定性的研究工作進行的還很少。 11113質(zhì)粒 DNA 作為擴增模板需要注意 的問題是 , 同無特性 DNA 作 目的片段相類似的 , 除致病性特點外 , 還要考 慮質(zhì)?；蜃鳛槟康钠蔚姆€(wěn)定性。在有些 情況下還要考察某一引物的適用范圍。舉例 來講 , 對于一個病原物種

8、的檢測有時只能檢 測到其中一部分 , 因為其種內(nèi)有些毒性菌系 不含目的質(zhì)粒。對黃單胞桿菌屬引起的菜豆 疫病的檢測就是這樣。有的 引物 10只能檢 測到番茄潰瘍病菌 (Clavibacter michigane -sis subsp. m ichiganensis 中 75%的 菌 系。 根據(jù)質(zhì)粒 Pcsl 設(shè)計的類似啟動 子序列的引 物對檢測馬鈴薯環(huán)腐病中有質(zhì)粒的菌系具有 專一性 , 但對質(zhì)粒 缺乏菌系 就檢測不 到了。 但一套根 據(jù)馬 鈴薯 環(huán)腐 病 (C. m. subsp. sep edonicus 質(zhì)粒衍生物設(shè)計的特異性引物 可以檢 測到所有 C. m. subsp. sep edon

9、icus 菌系 , 包括一個用其它引物檢測不到的可能 不含質(zhì)粒 的菌系。一種根據(jù) pEA29質(zhì)粒序 列設(shè)計的引物可專一敏感的檢測梨火疫病菌 (Erw inia amylovora 。所有 的被檢 菌系都 含有這一目標 DNA 。這種質(zhì)粒也許與適應(yīng) 性有關(guān) , 因此能夠在自然生長的梨火疫病病 菌中存留下來。最后還有一種情況 11, 在沒 有詳細闡述基因及其產(chǎn)物的情況下 , 根據(jù)木 薯枯萎病 (X . c. pv. manihotis (一種世界 范圍的檢疫對象 中與致病性相關(guān)的質(zhì)粒片 段設(shè)計引物 , 從 107個菌系中都可以得到一 個特異的 895bp 的 PCR 片段 , 而在 5種木薯 枯萎

10、病菌的非致病菌系及一些與這種黃單胞 近緣的或與木薯相關(guān)的其它腐生菌都沒有擴 增產(chǎn)物。所以質(zhì)粒 DNA 可作為一種可靠的檢測 和鑒定病害相關(guān) 的病原物 的檢測 目標。當 然 , 掌握目標質(zhì)粒 DNA 的本 質(zhì)特征和持久 性將對利用質(zhì)粒 DNA 檢測方案的長期的可 靠性大有裨益。112以 rDNA 為模板的 PCR 分析 11211rDNA -PCR根據(jù)不同細菌的 rDNA 的不同特征有很 多不同方案來對它們進行描述區(qū)分。個別的 細菌可能含有 1(支 原菌 到 14(梭菌屬 個 rRNA 基因組 , 這些基因組不 一定都是同源 的。根據(jù) DNA 保守區(qū)段設(shè)計的引物可用于 從一個大的系統(tǒng)發(fā)育不同的細

11、菌范圍中擴增 核糖體基因片段。已有充分的事實說明植物病原細菌當中 由基因?qū)е碌?rDNA 特異序列的存在 , 并針 對假單胞桿菌屬、 黃單胞桿菌屬和許多檢疫 對象設(shè)計了相關(guān)引物。 Widmer 等用一套具 有高度選擇性的引物得到了假單胞桿菌 16s rRNA 的基因片段?，F(xiàn)已證明用這些引物對 土壤假單胞桿菌的純 DNA 進行 PCR 擴增是 能夠有效的得到目的片段的。 Maes 等推出 一套能夠擴增一個對黃單胞桿菌特異的 480 -bp 的片段引物 , 通過結(jié)合一個通用的 16s rDNA 引物和一個對黃單胞桿菌特異的反向 引物能夠檢測小麥種子上的黃單胞桿菌。 T akeuchi 等 12測得

12、 6種布克氏菌和另 外兩種相關(guān)細菌種的 16s 和 23s rRNA 基因 間的整個區(qū) 間序列并具此 ITS 帶設(shè)計了專 一性引物來檢測水稻苗期病害的菌原物水稻 谷枯病菌 (B. plantar ii 和水稻 苗枯 病菌 (B. glumae 。 最近有人利用 16s rRNA 基因 中單堿基對變異連接酶連式反應(yīng)來特異性的 檢測 斯氏細菌性萎蔫病病原 Pantoea (Er-w inia stew artii 。rRNA 基因已被用來作為檢測目的基因 的 DNA 的高度敏感目標基因 , 但其區(qū)分能 力目前還在種或?qū)俚乃缴?。很?PCR 引 物的特性使它們對其它 PCR 方案都很適用 , 象特

13、異性很高的 ITS -PCR 。11212IT S -PCR:轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) -PCRITS -PCR 分析利用根據(jù)保守 16s 及 23s 核糖 體 設(shè) 計 的 引 物 來 擴 增 轉(zhuǎn) 錄 間 隔 區(qū) (ITS 。在 16s 及 23s rRNA 基 因間 的 ITS 區(qū)間可能包括一些 tRNA 基因和一些未編碼 區(qū) , 因此較 16s 和 23s rRNA 基因本身變異要 大。用通用引物進行 ITS -PCR 時可以根據(jù) PCR 產(chǎn)物 的數(shù) 量和 長度 檢測 和區(qū) 分細 菌。 如果從一種細菌中擴增出的條帶有變化 , 應(yīng) 是由不同 rDNA 長度變異引起的。實際上在 多 rDNA 基因組中 DN

14、A 的變異程度與近源 菌系間的變異程度相等?？梢酝ㄟ^限制性酶 切分析 ITS -PCR 擴增產(chǎn)物或分析 ITS 擴增 產(chǎn)物的 DNA 序列來增強特異性。Kim 和 Sony 13鑒定了 7種水稻病害病 原菌 , 包括假單胞菌屬、 黃單胞桿菌屬和歐氏 桿菌屬中的種。方法是 :先用通用引物擴增 , 獲得 16s 和 32s rRNA 基因 ITS -PCR 產(chǎn)物 , 然后設(shè)計特殊引物專一性的擴增 ITS 區(qū)。 113tDNA -PCRtRNA -PCR 方 法 是 利 用 了 tRNA -PCR 基因的固 有特性 , tRNA 基因常位于 16s 和 23s rRNA 基因的 ITS 帶或細菌 5

15、s rRNA 基 因末端。從被擴增區(qū)段外側(cè)設(shè)計一對引物對 tRNA 基因進行擴 增 , 得到不 同大小的擴增 產(chǎn)物的指紋圖譜 , 不同產(chǎn)物的產(chǎn)生就是由屬 或種的特異性造成的。 Pan 等結(jié)合 tRNA 引 物 Ala4和 ITS 的通用引 物 L1, 從甘蔗白條 病中擴增一個用于檢測的 360bp 的片段 , 可 以在待測樣品中含 15CFU 的情況下檢出 病原物。2與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合的 PCR 檢測方法 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)及動物醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的不斷發(fā) 展促進了血清學(xué)技術(shù)用于植物病原細菌的檢 測研究。應(yīng)用血清學(xué)技術(shù)檢測植物病原細菌 發(fā)展至今 , 對于植物病原細菌的檢測已是一 種較 為 成 熟的 技 術(shù)。目

16、 前 血 清 學(xué) 技 術(shù) 與 PCR 相結(jié)合應(yīng)用于病原細菌的檢測 , 提高了 檢測的靈敏度。主要有兩個大的方向 :211免疫 PCR (Immuno -PCR免疫 PCR 技術(shù)是 1992由 Sano T. 等 14最早使用的。該技術(shù)將血清學(xué)中抗原 -抗體 反應(yīng)的特異性與 PCR 的強特異擴增能力結(jié) 合起來 , 可以在短時間內(nèi)精確的檢測某一病 原物是否存在。免疫 PCR 的原理是 :用一段 具體的 DNA 分子標記抗體 , 應(yīng)用此抗體去 檢測抗原 , PCR 擴增此段 DNA 分子 , 根據(jù)擴 增產(chǎn)物存在與否判斷抗原是否存在。一般的 操作過程是 :在酶聯(lián)板內(nèi)包被用于捕獲抗原 的抗體 , 加 待

17、檢 抗原 , 再 加 DNA 標記 的抗 體 , 然 后 PCR 擴 增 抗 原 抗 體 復(fù) 合 物 上 的 DNA 片段 , 根據(jù) 電泳結(jié)果 判斷抗原 存在情 況。此種做法類似于 ELISA 中的雙抗體夾 心法。根 據(jù) 反應(yīng) 物 的不 同 , 目 前可 將 免疫 PCR 分為單分析物免疫 PCR 、 多分析物免疫 PCR 、 單引物免疫 PCR 、 和雙引物免疫 PCR 。 212免疫磁性分離 -PCR (IMS -PCR 磁性免疫微球 (immunomagnetic micro -sphere -IMM S 是近年發(fā)展起來的一類新型 功能性材料 , 它是磁性微球載體表面通過化 學(xué)或物理方法

18、連接上具有一定免疫活性的物 質(zhì)作為配體而研制成的。由于磁性微球粒徑 一般很小 , 比表面積大 , 故而偶聯(lián)容量較高 , 懸浮穩(wěn)定性較好 , 便于各種反應(yīng)高效而方便 的進行 ; 又因其具有順磁性 , 在外電場的作用 下固液相的分離十分簡單 , 可省去過濾、 離心 等繁雜操作 , 并可在磁場作用下定位 , 方便地 進行分離同配體相對應(yīng)的物質(zhì)。目前免疫磁 性分離技術(shù)已應(yīng)用于細胞標記、 細胞分離、 臨 床 PCR 檢測 等方面 1516。應(yīng)用于 種子帶 菌檢測的具體做法是 :包括于 IM MS 上的抗 體選擇性吸附目標菌 , 洗掉未吸附的污染物 (土壤顆粒、 植物殘渣和非目標菌 ; 然后對目 標菌擴增

19、培養(yǎng) (此步也可省略 , 進行 PCR 擴 增目的片段 , 根據(jù)所得結(jié)果判斷目標菌是否 存在。 IMS -PCR 的特點是對目 的菌進行了 二步檢測 , 一是血清的作用 , 二是 PCR 的作 用。這樣在保證了檢測速度的情況下 , 提高 了檢測的可靠性。在檢測西瓜細菌性果斑病 的試驗中 R. R. Walcott 等證明了 IM S -PCR 的靈敏度 比直接 PCR 高 100倍 , 而 且不受 PCR 抑制因子的影響。3展望隨著國際貿(mào)易自由化程度不斷加深 , 國 際間農(nóng)產(chǎn)品的交易日漸頻繁 , 種子的進出口 檢疫工作顯得日益重要。在這一方面 , 我國 著實應(yīng)當向發(fā)達國家學(xué)習(xí) , 加強種子檢疫

20、研 究。傳統(tǒng)的檢測方法 , 如 :解剖檢測法、 洗滌 檢測法、 分離培養(yǎng)檢測法、 熒光反應(yīng)檢測法、 化學(xué)染色檢測法、 噬菌體檢測法、 生物測定檢 測法、 離體培養(yǎng)檢測法等 , 操作相對粗放 ; 精 確度低 ; 耗時長 ; 靈敏度差 ; 需要多種方法配 合使用。而電鏡檢測、 實時 PCR (RT -PCR 等精度較高、 速度快 (RT -PCR 可以在采集到 樣品之后的 1個小時內(nèi)得出可靠檢測結(jié)果 的方法 , 一方面儀器設(shè)備昂貴 , 另一方面對操 作人員的技術(shù)水平要求也較高 , 如直接應(yīng)用 到實踐中還存在一定困難?？茖W(xué)的發(fā)展尤其 是免疫學(xué)和分子生物學(xué)日新月異的進步 , 將 使用于檢測種傳植物病原

21、細菌的方法不斷突 破舊的局限 , 使新的、 適應(yīng)不同需要的方法層 出不窮。目前 , 我們正在用免疫磁性分離法 針對番茄細菌性斑點病種子帶菌情況進行研 究 , 用全菌體抗原和膜蛋白抗原制備抗體 , 得 到了效價分別為 640和 1280(試管凝集法 的抗血清 , 為后繼工作打下了基礎(chǔ)?？偟膩?說新的分析 手段將向 短時間、 高精度、 自動 化、 微量化、 盡量減少人為因素的方向發(fā)展 , 這無疑會給不同檢測目的的需要不斷提供更 合適的方法。然而任何一種方法都有其適用 范圍 , 對于不同目標的檢測 , 得到靈敏度、 可 靠性和高效性的最優(yōu)組合 , 制訂標準化方案 , 仍是我們面臨的重要問題。參考文獻

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