3.小鼠解剖及動物原代細(xì)胞培養(yǎng)

1、實驗三、小鼠解剖及動物原代細(xì)胞培養(yǎng)引言 ： 細(xì)胞培養(yǎng)指的是在無菌條件下，把動、植物細(xì)胞從組織中取出，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境， 使離體的細(xì)胞在體外生長和繁殖， 并且維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。 動物細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。 從供體獲得組織細(xì)胞， 在無菌條件下， 用胰蛋白酶消化或機(jī)械分散等方法， 將動物組織分散成單個細(xì)胞開始首次培養(yǎng)長出單層細(xì)胞的方法稱為細(xì)胞的原代培養(yǎng)。 當(dāng)培養(yǎng)的動物細(xì)胞生長增殖達(dá)到一定密度， 形成致密的單層細(xì)胞時， 用胰蛋白酶將細(xì)胞消化分散成單細(xì)胞， 從一個容器中以 1： 2 或其他比例轉(zhuǎn)移到另一個容器中擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，稱為細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的累計次數(shù)就是細(xì)

2、胞的培養(yǎng)代數(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的意義:具有其他生物技術(shù)無可比擬的優(yōu)點；培養(yǎng)條件易改變和控制， 便于單因子分析； 便于人們直接對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、 細(xì)胞生長及發(fā)育等過程的觀 察；在生物學(xué)的各個領(lǐng)域（如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)及病毒學(xué)等）已被廣泛應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)的局限性： 在脫離機(jī)體復(fù)雜環(huán)境下， 細(xì)胞培養(yǎng)條件與軀體環(huán)境有一定距離；觀察到的結(jié)果有時難以正確反映機(jī)體內(nèi)的狀況；細(xì)胞培養(yǎng)得到的產(chǎn)物 少。培養(yǎng)細(xì)胞的條件有水的質(zhì)量、無菌環(huán)境，最適溫度、滲透壓、氣體條件、最適PH、營養(yǎng)條件和培養(yǎng)基質(zhì)等。1 .實驗材料 ：實驗室購買的雄性小鼠、 13.5天孕鼠。DMEM培養(yǎng)基（胎牛血清、青/鏈霉素溶液）、胰

3、蛋白酶溶液、PBS溶液（NaCl 8.00g, Na2HP04 1.15g， KCl 0.20g， KH2P04 0.20g， pH 調(diào)至 7.2，超純水定容到1000mL，分裝， 121 滅菌 20 min）2 .實驗步驟：2.1 處死小鼠用右手拇指和食指捏住雄性小鼠或懷孕雌鼠尾巴中部放在鐵籠上， 使小鼠前肢接觸鐵籠（后肢懸空） ，左手從小鼠后方向前按住鼠頭及頸部。左手拇指、食指用力向下按壓鼠頭及頸部， 同時右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方， 造成頸椎脫臼， 造成小鼠立即死亡。 當(dāng)小鼠停止抽搐， 松開左手。 將整個小鼠浸入盛有75%乙醇的燒杯中。2.2 解剖小鼠將雄性小鼠或懷孕雌鼠從燒杯中移入

4、超凈臺取出后放在無菌大平皿中， 用碘酒棉球消毒腹部的被毛， 然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦過的部位。 用鑷子提起腹部皮膚，剪刀剪開皮膚，打開腹腔，將剪開的皮膚分別拉向兩邊。觀察小鼠內(nèi)臟器官。2.3 小鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)用鑷子及剪刀，剪開腹腔。取出腎臟，置于無菌培養(yǎng)皿中，加入少量 PBS 洗液。換眼科剪及鑷，將腎膜剪破，去掉腎膜、脂肪及腎盂。將腎組織轉(zhuǎn)移于另一無菌培養(yǎng)皿， 換彎頭眼科剪， 將腎組織剪碎至約 1 立方毫米大小，加入 PBS 洗液洗滌，吸掉洗液，重復(fù)數(shù)次，直到洗液澄清、無血球 為止。用大口徑槍頭將上述組織液轉(zhuǎn)移至 50ml 離心管。靜止1 分鐘，換小口徑槍頭吸掉洗液。按組織總體積的 10 倍量

5、加入0.25%胰蛋白酶液，置于37水浴酶解消化60分鐘左右。每隔 5 分鐘搖動一次。從水浴中取出，吸掉棄去胰蛋白酶液，向離心管加入5毫升DMEM培養(yǎng)液反復(fù)吹打組織塊至細(xì)胞懸液。吸取少量細(xì)胞懸液， 用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。 根據(jù)上述計數(shù)結(jié)果， 調(diào)整細(xì)胞 終濃度至每毫升含3050萬個細(xì)胞進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。一周內(nèi)每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)情 況、拍照。3 .結(jié)果與討論第一天：小鼠腎細(xì)胞濃度1:36 / 6第二天:小鼠腎細(xì)胞濃度1:1小鼠腎細(xì)胞濃度1:2小鼠腎細(xì)胞濃度1:3第四天:小鼠腎細(xì)胞濃度1:1小鼠腎細(xì)胞濃度1:2小鼠腎細(xì)胞濃度1:3實驗結(jié)論討論：第一天小鼠腎細(xì)胞濃度1:1和1:2的培養(yǎng)瓶顏色由紅色變?yōu)辄S色，我

6、們推測為細(xì)胞濃度太高而培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，但是第二天之后變色的培養(yǎng)瓶又變回了原本的紅色，但是不清楚原因是什么。雖然我們組沒有第三天 的圖片，不過從第二天和第四天可以明顯看出小鼠腎細(xì)胞的生長軌跡。不過通過第一天到第四天的圖片可以看出小鼠腎細(xì)胞濃度1:1的培養(yǎng)瓶內(nèi)無法找到明確的細(xì)胞，濃度太高營養(yǎng)物質(zhì)耗盡細(xì)胞死亡，而小鼠腎細(xì)胞濃度1:2的培養(yǎng)瓶雖然中途變過色，但是從第四天的觀察來看，該培養(yǎng)瓶內(nèi)有細(xì)胞生長，說明細(xì)胞沒 有死亡，但不清楚培養(yǎng)基中途變色的原因，猜測可能是剛開始的時候培養(yǎng)瓶的蓋 子擰太緊而導(dǎo)致細(xì)胞缺氧。而小鼠腎細(xì)胞濃度1:3從第一天到第四天的圖片對比 可看出小鼠腎細(xì)胞在1:3的濃度下能夠正常生長，而且第四天小鼠腎細(xì)胞已經(jīng)分 散，細(xì)胞明顯。因此可以得出結(jié)論1:3的濃度更加適