層析分離技術(shù).

1、溶質(zhì)在固定相停留的時(shí)間分?jǐn)?shù)= qs _ k' qs qm 1 k'k' = qs 二 KVsqmVm溶質(zhì)在流動(dòng)相停留的時(shí)間分?jǐn)?shù)qm _1qsqm 1k色層分離技術(shù)色層分離：是一組相關(guān)技術(shù)的總稱，也稱為色譜分離或?qū)游龇蛛x。按固定相的基質(zhì)（載體）類型分類：層析：載體一般為軟基質(zhì)的凝膠，常用的有纖維素、瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝 膠等，只適合在低壓下操作。色譜：載體一般為高強(qiáng)度的經(jīng)過(guò)表面該性的硅膠、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，適合在高壓下使用。也有人將層析稱為色譜。用途：用在產(chǎn)品的精制階段，目標(biāo)是獲得合乎使用要求的產(chǎn)品。層析：一般用于生物大分子或酶的批量純化

2、。高壓液相色譜：具有生物活性的小分子物質(zhì)的分離純化。色層分離過(guò)程包含兩部分：固定相：載體或載體+功能基團(tuán)流動(dòng)相（洗脫液）：緩沖液或有機(jī)溶劑對(duì)于高壓液相色譜和低壓層析，操作模式有很大區(qū)別。液相色譜的基本原理和參數(shù)保留時(shí)間（tR）和保留體積（VR）從進(jìn)樣開(kāi)始到后來(lái)出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時(shí)間為保留時(shí)間，用tR表示。在這段時(shí)間內(nèi)沖洗劑（流動(dòng)相）流過(guò)的體積為保留體積，用Vr表示。vR=tR.F理論塔板數(shù)的計(jì)算公式為：N =（9）2容量因子k和平衡常數(shù)K某物質(zhì)的k定義為在分配平衡時(shí)該物質(zhì)在兩相中絕對(duì)量之比。而平衡常數(shù)K為平衡時(shí)，物物質(zhì)在固相的量（qs）物質(zhì)在固相的儂度（qs /Vs）質(zhì)在兩相的濃度比:

3、=K = '.一 物質(zhì)在流動(dòng)相的量（qm）物質(zhì)在流動(dòng)相的儂度（qm/Vm）Vs和Vm分別為柱內(nèi)固定相和流動(dòng)相所占的體積。于是有8 / 7在柱內(nèi)溶質(zhì)只有轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相時(shí)才能沿柱的方向向前移動(dòng)，所以對(duì)于一個(gè)在柱內(nèi)有保留的溶質(zhì)，其譜帶移動(dòng)速度（uj總是小于流動(dòng)相的移動(dòng)速度 （um,而等于流動(dòng)相的移動(dòng)速度與該譜帶對(duì) i、應(yīng)的溶質(zhì)在流動(dòng)相停留的時(shí)間分?jǐn)?shù)之積：ub =um（）1k,而當(dāng)柱長(zhǎng)一定時(shí)，溶質(zhì)譜帶的移動(dòng)速度和流動(dòng)相的移動(dòng)速度與它們通過(guò)柱子所花費(fèi)的時(shí)間成反比:oUb tRUmtRtR =tR(1 k')當(dāng)柱外死體積可忽略不計(jì)時(shí)，VR =VmVr =Vm Vmk'=Vm KVsk

4、' = t0_1 =,0,tR -tRtRtRtRvR =vt Rk, 二一-1 二tRt R -t Rt RRRRtRtR柱效率： 塔板高度（H）和塔板數(shù)（N）是衡量色譜柱效率的兩個(gè)重要指標(biāo)。塔板高度（H）：在某一段柱長(zhǎng)范圍內(nèi)溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間達(dá)到分配平衡，這段柱長(zhǎng)就相 當(dāng)于一個(gè)理論塔板的高度 （HETP或H）。理論塔板數(shù)的計(jì)算公式為：N =（墟）2式中tR為標(biāo)準(zhǔn)偏差。理論塔板高度為：H = 式中，L 一柱長(zhǎng)。N塔板高度小，塔板數(shù)高，色譜分離效率高。（SM0 GFC的分離厚理及沈風(fēng)曲績(jī)影響柱效的因素（1）理論塔板高度隨填料粒度減少而減少；（2）在一定范圍內(nèi)流速減小有利于提高柱效

5、；（3）減少?zèng)_洗劑粘度或提高柱溫有利于柱高減??；（4）分子量較小的樣品分子柱高較小。色層分離的類型凝膠篩分離子交換反向色譜疏水色譜（層析）親合色譜（層析）凝膠過(guò)濾層析（體積排阻色譜）Gel filtration chromatography,GFCSize exclusion chromatograpy , SEC是一種純粹按照溶質(zhì)分子在溶液中的體積大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)。應(yīng)用：主要用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分級(jí)分離和 除鹽。一般用作原料液的初分離，獲取 幾個(gè)不同分子量物質(zhì)分級(jí)，供進(jìn)一步分離純化使用。分離原理：含有不同分子大小的樣品進(jìn)入色譜柱（層析柱）后，較大的分子不能通過(guò)孔道擴(kuò)散進(jìn)入填 料顆粒

6、（凝膠珠體）內(nèi)部，而與流動(dòng)相一起先流出色譜柱（層析柱）。較小的分子可通過(guò)部分孔道、更小的分子可通過(guò)任意孔道擴(kuò)散進(jìn)入顆粒（珠體）內(nèi)部。這種顆粒內(nèi)部擴(kuò)散的結(jié)果，使小 分子沿柱流動(dòng)的速度減慢，使混合樣品中不同的分子按分子大小的順序流出色譜柱（層析柱） 從而達(dá)到分離的目的。凝膠過(guò)濾介質(zhì)：良好的凝膠過(guò)濾介質(zhì)應(yīng)滿足如下要求：（1）親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；蛋白質(zhì)的分級(jí) 和除鹽效果只與溶質(zhì)的相對(duì)分子量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu)（孔徑分布）有關(guān)，與所用洗脫液的 pH值和離子強(qiáng)度等物性無(wú)關(guān)。（2）穩(wěn)定性強(qiáng)，在較寬的pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)；（3）具有

7、一定的孔徑分布范圍；（4）機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力。常用的分離介質(zhì)天然及高分子介質(zhì)經(jīng)常使用的是葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖（Sepharose）、瓊脂糖與葡聚糖接枝而成的 復(fù)合凝膠（Superdex）以及聚丙烯酰胺類和聚乙烯醇類合成凝膠（ TSKgel）。（一）交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）Sephadex G交聯(lián)葡聚糖的商品名為 Sephadex,不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水 2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水 20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10, G-15, G-25, G-50

8、, G-75, G-100,G-150,和G-200o因此，“G反映凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。 Sephadex LH-20 , 是一Sephadex G-25的竣丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。（二）瓊脂糖凝膠：商品名很多，常見(jiàn)的有，Sepharose （瑞典，pharmacia ）, Bio-Gel-A （美國(guó)Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵來(lái)維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40c以上開(kāi)始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅

9、菌活處理。（三）聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠 P (Bio-Gel P),由美國(guó)Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號(hào)很多，從P-2至P-300 共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。四)聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ,具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量 1600到40, 000, 000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用 甲基亞碉。凝膠過(guò)濾的特點(diǎn)是：填料

10、多為帶有羥基、但不帶電荷的惰性材料，親水性能好，又不與待分離物質(zhì)發(fā)生作用， 因此分離條件溫和，蛋白質(zhì)回收率高，重現(xiàn)性好；工作范圍廣，分離分子量的覆蓋面大可分離 幾百到數(shù)百萬(wàn)分子量；設(shè)備簡(jiǎn)單、易于操作，周期短。填料再生性好，可連續(xù)使用數(shù)百次到上 千次。功能脫鹽：分離大小兩類不同的分子即無(wú)機(jī)鹽與生物大分子；分級(jí)：將分子大小相近的物質(zhì)分開(kāi)，通常為大分子間的分離。缺點(diǎn)：凝膠強(qiáng)度低，可耐受的壓力通常低于 0.2個(gè)大氣壓，故流速低，通常的線速度小于 20cm/h。 因此，處理速度較慢。但Superdex的最大耐受壓力可達(dá) 15個(gè)大氣壓，流速也提高近 10倍。無(wú)機(jī)填料：表面改性后的硅膠，主要是用有機(jī)物或聚合

11、物對(duì)硅膠顆粒進(jìn)行處理，增加其親水性并消除或抑制體積排阻以外的其他效應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：可耐受較高的壓力，最高壓力可達(dá)上百個(gè)大氣壓。具有較高的柱效率和分離度。缺點(diǎn)：pH的適用范圍窄。以硅膠為基質(zhì)的填料，pH范圍在2.0-7.0,如果超過(guò)了這個(gè)范圍，將會(huì)使有機(jī)層的溶解速率加快，減少柱子壽命。凝膠特性參數(shù)11)排阻極限(exclusion limit):凝膠過(guò)濾介質(zhì)的排阻極限是指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子質(zhì)量。不同的凝膠過(guò)濾介質(zhì)品牌具有不同的排阻極限。Sephadex G50的排阻極限是30kD。Sephadex G-50 的(2)分級(jí)范圍(fractionation range):即能為凝膠

12、阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。分級(jí)范圍為1.5 30kD.(3)溶脹率：某些市售的干燥凝膠顆粒(如Sephadex G系列)，使用前要用水溶液進(jìn)行溶脹處理，溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分率稱為溶脹率，即溶脹率(溶脹處理平衡后重量-干燥重量)干燥重量100%Sephadex G50 的溶脹率為 500% ±30%。(4)凝膠粒徑：一般為球形，其粒徑大小對(duì)分離度有重要影響。粒徑越小，分離效率越高。軟凝膠粒徑較大， 一般為50 150 M-m,硬凝膠粒徑較小， 一般為5 50 Nm。Sepharose和 Sephadex凝膠粒徑分布為 45 165 Mm,而 S

13、uperdex 和 TSK Toyopearl HW 系列可小到 20 40 Nm,甚至 6 10 Mm。(5)床體積(bed volume)即1g干燥凝膠溶脹后所占的體積。Sephadex G50的床體積為9 11cm3/g干膠。(6)空隙體積(void volume)指層析柱中凝膠之間空隙的體積，即Vo值?？障扼w積可用相對(duì)分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測(cè)定。一般使用相對(duì)分子質(zhì)量為2000kD的水溶性蘭色葡聚糖。影響分離特性的因素1、填料分離度和蛋白質(zhì)的分離范圍以及最小分子量之比是選擇填料要考慮的首要問(wèn)題。目前TSK系列凝膠柱被認(rèn)為是最好的蛋白質(zhì)分離柱，其特點(diǎn)是分離度高和吸附性小。2、柱長(zhǎng)體積排

14、阻色譜的分離度與柱長(zhǎng)的平方根成正比，因此應(yīng)根據(jù)分離的要求確定柱長(zhǎng)，一般柱長(zhǎng) 60-120 厘米對(duì)于蛋白質(zhì)的分離比較理想，而長(zhǎng)30 厘米的柱子多用于快速分離。3、洗脫液洗脫液的pH 值和離子強(qiáng)度都將影響到分離效果。以硅膠為基質(zhì)的填料，pH 范圍在 2.0-7.5,如果超出這個(gè)范圍，將會(huì)使鍵合相的有機(jī)層溶解。當(dāng)離子強(qiáng)度很低時(shí)，TSK 系列凝膠柱上的硅醇基會(huì)與待分離的蛋白發(fā)生離子反應(yīng)，一般通過(guò)加入0.3-0.5mol/L 的 NaCl 來(lái)抑制。蛋白質(zhì)和柱填料的疏水作用一般通過(guò)加入5-10% 的乙醇或異丙醇來(lái)控制。3、流速是影響蛋白質(zhì)分離的重要因素。一般流速低分離效果好。如流速在小于0.1ml/min

15、 時(shí)，蛋白質(zhì)的分離度好；在0.5-1.0ml/min 時(shí)，對(duì)于7.5mm 直徑的柱子，分離效率較高。4、樣品容量進(jìn)樣體積和樣品濃度將明顯影響到蛋白質(zhì)的分離度，高濃度、小體積對(duì)分離有利。合適的蛋白質(zhì)樣品濃度范圍一般在0.01-0.5%，樣品體積是柱體積的1-3%。凝膠篩分的應(yīng)用1 、分離純化GFC 可用于相對(duì)分子量從幾百到百萬(wàn)的物質(zhì)的分離純化，是蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、抗生素、糖類、核酸以及病毒（50-400nm）的分離與分析中頻繁使用的液相層析法。2、脫鹽鹽析沉淀中得到的高鹽濃度的蛋白質(zhì)溶液用凝膠法脫鹽后，可用于其它層析過(guò)程。也可用于緩沖液的置換。3、相對(duì)分子量的測(cè)定通過(guò)分子量與分配系數(shù)的線性關(guān)系進(jìn)

16、行測(cè)量，對(duì)球形分子較準(zhǔn)確。4、用于包含體的復(fù)性實(shí)驗(yàn)技術(shù)（一）層析柱層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2 厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過(guò)高擠壓變形阻塞，一般不超過(guò)1 米。分族分離時(shí)用短柱，一般凝膠柱長(zhǎng)20-30厘米，柱高與直徑的比較 5:1 10:1,凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級(jí)分離時(shí)柱高與直徑之比為20:1 1

17、00:1,層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支撐濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時(shí)，死體積不能超過(guò)總床體積的1/1000。（二）凝膠的選擇根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex G-200的吸水量為20, 1克Sephadex G200吸水后形成的凝膠體積約 40ml 。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度小分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200 號(hào)篩目的Sephadex G-200 效果好，脫鹽用Sephadex

18、 G-25、 G-50，用粗粒，短柱，流速快。（三）凝膠的制備商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大加速膨脹，通常在1-2 小時(shí)內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí)，自然膨脹需24 小時(shí)至數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。（四）樣品溶液的處理樣品溶液如有沉淀應(yīng)過(guò)濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過(guò)Sephadex G-15 短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過(guò)4，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分

19、離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4（一般約0.5-2ml） ，進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。（五）防止微生物的污染交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長(zhǎng)，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有：疊氨鈉(NaN3)：在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長(zhǎng)，疊氮鈉易溶于水，在20c時(shí)約為40%;它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)?？蓸?lè)酮Cl3C-C(OH)(CH 3)2

20、在凝膠層析中使用濃度為0.01- 0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果最佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60c時(shí)易引起分解而失效。乙基汞代疏基水楊酸鈉：在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0.01%。在微酸性溶液中最為有效。重金屬離子可使乙基代疏基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。(4)苯基汞代鹽 在凝膠層析中使用濃度為 0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果最佳，長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦 可降低或抑制它的抑菌作用。GFC分離的優(yōu)點(diǎn)：(1)由于溶質(zhì)不與介質(zhì)發(fā)生作用，可采用恒定洗脫法洗脫，操作

21、條件溫和?；厥章士蛇_(dá)100%;(2)使用后，不需要進(jìn)行柱子的清洗和再生，利于循環(huán)使用；(3)作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切率小，蛋白活性回收率高；(4)分離機(jī)理簡(jiǎn)單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。缺點(diǎn)(1)選擇性低，料液處理量小；(2)洗脫展開(kāi)后產(chǎn)品被稀釋，因此還需要具有濃縮作用的單元操作。色層分離技術(shù)2反相作用色譜反相色譜(revelsed phase chromatography, RPC)是基于溶質(zhì)、極性流動(dòng)相和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式。任何一種有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)中都有非極性的疏水部分，這 部分越大，一般保留值越高。固定相：用短鏈烷基(如C4

22、, C8,苯基)和長(zhǎng)鏈烷基(如C18,C22)改性的孔徑在30納米以上的硅 膠烷基鍵合相。流動(dòng)相：有機(jī)溶劑主要是乙睛、異丙醇、正丙醇和四氫吠喃等。有機(jī)溶劑和水組成的洗脫體系 可以得到高的蛋白回收率。流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度是隨著有機(jī)溶劑的強(qiáng)度增加而增加。其次序?yàn)椋?乙睛七醇丙醇異丙醇 四氫吠喃。實(shí)驗(yàn)表明：烷基鏈長(zhǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的反相保留沒(méi)有顯著的影響，但在蛋白質(zhì)的活性回收上短鏈烷基(如C4,C8,苯基)和長(zhǎng)鏈烷基(如C18, C22)反相填料是有區(qū)別的。表現(xiàn)在烷基鏈越長(zhǎng)，固定相的疏水性 越強(qiáng)，因而為使蛋白質(zhì)較快洗脫下來(lái)，需要增加流動(dòng)相的有機(jī)成分；過(guò)強(qiáng)的疏水性和過(guò)多的有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不可逆吸附和生物活性

23、的損失。應(yīng)用領(lǐng)域：蛋白質(zhì)、多肽、核糖核酸、脫氧核糖核酸、信息核糖核酸等的分離和制備。疏水作用層析(色譜)一、原理疏水作用層析(HIC):是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)的疏水吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏 水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。 二、疏水性吸附劑將下表所列的各種凝膠過(guò)濾介質(zhì)偶聯(lián)上疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。常用的疏水性配基：苯基、短鏈烷基(C3C8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醍等。吸附特點(diǎn)：疏水性吸附作用的大小與配基的疏水性(疏水鏈長(zhǎng)度)和配基密度成正比，故配基修飾密 度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，疏水性高的配基較疏水性低的配基修飾密度低。一

24、般配基修飾密 度在10 40Mmol/ml ,配基修飾密度過(guò)小則疏水性吸附不足，密度過(guò)大則洗脫困難。三、HIC操作上樣及洗脫的一般規(guī)律在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；濃度降低時(shí)，疏水作用減弱，逐步被洗脫下來(lái)。一般用 pH 6-8的鹽水溶液如(NH4) 2SO4。鹽的濃度影響蛋白質(zhì)的疏水性，從而影響蛋白質(zhì)的保留值。鹽：Na2SO4, KH2P。4, NaHPO4, (NH 4"SO4, NH4OAC, KOAc , NaOAc ,NaCl鹽析作用增強(qiáng)洗脫能力增強(qiáng)1、影響疏水性吸附的因素蛋白質(zhì)的疏水性與其荷電性質(zhì)相比復(fù)雜得多，不易定量掌握。除疏水性吸附劑的性質(zhì)(疏水性配基的結(jié)構(gòu)和修飾密度)外，流動(dòng)相的組成以及操作溫度對(duì)蛋白質(zhì)疏水性吸附的強(qiáng)弱均產(chǎn)生重 要影響。(1)離子強(qiáng)度及種類蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強(qiáng)度提高而增大。離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價(jià)陰離子的存在下作用力較高。因此HIC分離過(guò)程中主要利用硫酸錢(qián)、硫酸鈉和氯化鈉等鹽溶液為流動(dòng)相，在略低于鹽析點(diǎn)的鹽濃度下進(jìn)料，然后逐漸降 低流動(dòng)相離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫分離。(2)破壞水化作用的物質(zhì)SCN"Cl。4-I -箋堂子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互HPO：-等)的作用 SO2&qu