家兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型的建立

1、家兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型的建立        【摘要】     目的：探索建立家兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的模型，并探討軟骨細(xì)胞的病理生理改變。方法：取新西蘭大白兔8只，隨機(jī)分成兩組，每組4只，實(shí)驗(yàn)組建立Hulth骨性關(guān)節(jié)炎模型，對(duì)照組僅行雙側(cè)膝關(guān)節(jié)切開術(shù)。8周后，處死動(dòng)物，選用兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨為試驗(yàn)標(biāo)本，兩組分別進(jìn)行軟骨細(xì)胞細(xì)胞生長曲線的測(cè)定。結(jié)果：骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞細(xì)胞周期較正常軟骨細(xì)胞細(xì)胞周期短，可以推斷骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞功能均發(fā)生改變。結(jié)論：骨

2、性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，軟骨細(xì)胞正常分化及增殖發(fā)生改變，可能為骨性關(guān)節(jié)炎軟骨代謝紊亂假說提供理論依據(jù)。     【關(guān)鍵詞】  骨性關(guān)節(jié)炎 動(dòng)物模型 軟骨細(xì)胞    材料與方法    試劑：化學(xué)試劑：碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、考馬斯亮蘭。細(xì)胞培養(yǎng)試劑與培養(yǎng)板：F12培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（寶泰克）、膠原酶、型、L-谷氨酰胺、二巰基乙醇、青霉素、鏈霉素、6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板。    儀器：凝膠成像儀、數(shù)碼照相系統(tǒng)、二氧化

3、碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、PCR擴(kuò)增儀、超聲波清洗器、倒置顯微鏡、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、CLP-800電泳儀、超高速冷凍離心機(jī)、梅特勒-托利多AB204-N單量程萬分之一電子天平、超小型電泳儀Mupid-2。    實(shí)驗(yàn)材料：新西蘭大白兔。    動(dòng)物模型及分組：雄性新西蘭白兔8只，35個(gè)月齡，體重2.53.5kg，平均2.85kg。隨機(jī)分兩組，每組4只。    手術(shù)方法：實(shí)驗(yàn)組：用20%烏拉坦(5ml/kg)靜脈麻醉，取髕內(nèi)側(cè)切口長約2cm，逐層切開軟組織，打開關(guān)節(jié)腔，將髕骨外翻，將雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶切

4、斷并切除內(nèi)側(cè)半月板，注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨；沖洗關(guān)節(jié)腔后，逐層縫合切口，術(shù)后應(yīng)用肌注青霉素40萬U/日，持續(xù)7天，術(shù)后不固定傷肢，每天驅(qū)趕兔奔跑2次，每次強(qiáng)迫其活動(dòng)1小時(shí)，模型建立需8周。對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用同樣的麻醉方法，只打開關(guān)節(jié)腔后，同樣將髕骨脫位，保持關(guān)節(jié)腔暴露時(shí)間大致同實(shí)驗(yàn)組，其余處理同上。    取材鑒定：手術(shù)后 8 周空氣栓塞處死動(dòng)物，無菌條件下取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)組軟骨面色澤灰暗，表面粗糙糜爛，軟骨下骨外露，骨贅增生明顯，尤以脛骨內(nèi)側(cè)髁明顯。對(duì)照組軟骨表面光滑，色澤正常，未見軟骨表面裂紋及凹陷，無骨贅形成。    主要實(shí)

5、驗(yàn)試劑及藥物制備：D-Hank's平衡鹽溶液：電子天平分別稱量NaCl 8.00g/L、KCl 0.40g/L、NaHPO4·H2O 0.06g/L、KH2PO4 0.06g/L、NaHCO3 0.35g/L、酚紅0.02g/L，加入去離子水溶解，攪拌均勻，加入青霉素20萬U/ml 500l、鏈霉素20萬U/ml 500l，定容至1000ml，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，過濾除菌備用。F12細(xì)胞培養(yǎng)液：電子天平分別稱量NaHCO3 2g、MgSO4 74.64mg/L、葡萄糖2g，加入F12干粉中，用去離子水溶解，加入青霉素20萬U/ml 500l、鏈霉素20萬U/ml 500

6、l，攪拌均勻，定容至1000ml，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.6，過濾除菌并以500ml/瓶分裝，按比例加入胎牛血清、2-ME及L-谷氨酰胺，4備用。    軟骨細(xì)胞提取與培養(yǎng)：將手術(shù)收集的軟骨標(biāo)本放入10ml無菌玻璃平皿，倒入D-Hank's液掩蓋標(biāo)本；在另一平皿中，加入少量F12培養(yǎng)液，用手術(shù)刀切碎軟骨，使成12mm3的小塊；移入離心筒中，用F12培養(yǎng)液掩蓋，離心1000rpm 5分鐘；收集全部切碎軟骨，除去F12，加入8ml 1×透明質(zhì)酸酶，室溫下作用5分鐘；除去透明質(zhì)酸酶，另加入16ml透明質(zhì)酸酶，室溫下作用10分鐘；祛除透明質(zhì)酸酶，用F12清

7、洗兩遍，每次10ml，離心1000rpm 5分鐘。用1×膠原酶4ml清洗5分鐘，祛除清洗液；加入8ml膠原酶，37培養(yǎng)30分鐘，離心600rpm 5分鐘；保留上清至無菌離心筒中；加入20ml膠原酶，37培養(yǎng)90分鐘繼續(xù)消化；視組織消化程度，一般消化至組織蓬松，呈絮狀；收集上清液，1000rpm離心8分鐘，獲得細(xì)胞團(tuán)；棄上清，將細(xì)胞懸浮于16mlF12培養(yǎng)液中，200目過濾至新無菌離心筒中。10l移液器取細(xì)胞懸液1l，計(jì)數(shù)。按5×104接種于培養(yǎng)瓶中。37、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24日，F(xiàn)12培養(yǎng)液換液1次。    軟骨細(xì)胞生長曲線的測(cè)定：取生長

8、狀態(tài)良好的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。經(jīng)計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞以1×104/ml接種于24孔板中；每隔1天取3個(gè)孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，培養(yǎng)24天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液；以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，將計(jì)數(shù)點(diǎn)連接成曲線。    結(jié)果與分析    骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織病理：顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組軟骨表面出現(xiàn)潰瘍，各層結(jié)構(gòu)界限消失，潮線紊亂乃至多重，軟骨細(xì)胞減少，但大量簇集。對(duì)照組軟骨表面光滑，層次清楚，軟骨細(xì)胞排列整齊，分布均勻，潮線清晰完整，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常，無簇集。    軟骨細(xì)胞：骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)

9、胞形態(tài)相似，為貼壁細(xì)胞，呈多角形，偶可見梭形，原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)軟骨細(xì)胞呈島狀生長；傳代軟骨細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞飽滿、透明，細(xì)胞多層生長時(shí)，可見細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)。    正常、骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞生長曲線：傳代正常、骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞近似“S”形，生長周期約在3周，經(jīng)過1周的潛伏期，軟骨細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，2周左右達(dá)到平臺(tái)期后穩(wěn)定生長，本實(shí)驗(yàn)選用作圖法，即在細(xì)胞生長曲線的對(duì)數(shù)生長期找出細(xì)胞增加一倍所需時(shí)間。據(jù)觀察，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞生長周期較正常軟骨細(xì)胞生長周期短，且于傳代培養(yǎng)11.5周兩種軟骨細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期，適于進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。   

10、; 討論    可能引起骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的病因很多，大致可分三類：外力導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷；軟骨細(xì)胞應(yīng)答基質(zhì)降解和軟骨修復(fù)能力的下降；由于骨重構(gòu)、滑膜應(yīng)答、微骨折、血管變化以及其他軟骨外因子等初級(jí)因素，進(jìn)而引發(fā)關(guān)節(jié)病變1。    骨性關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞和喪失機(jī)制還不清楚，但其病理過程可劃分為三個(gè)相互交叉的階段，即軟骨基質(zhì)的改變，軟骨細(xì)胞對(duì)組織損傷的改變，軟骨細(xì)胞合成代謝衰退及軟骨組織的進(jìn)行性喪失2?？梢娷浌羌?xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨中惟一的一種細(xì)胞，其功能決定著骨性關(guān)節(jié)炎的轉(zhuǎn)歸，軟骨細(xì)胞功能的異常是骨性關(guān)節(jié)炎變化的開始和關(guān)鍵3。 

11、   軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)比較：在軟骨細(xì)胞分離方面，正常與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分離方法存在差異，主要反映在對(duì)、型膠原酶的使用上。正常與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨消化對(duì)膠原酶具有高度選擇性，通過反復(fù)交叉實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，欲獲取骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，應(yīng)選擇型膠原酶對(duì)軟骨進(jìn)行消化；而欲獲取正常軟骨細(xì)胞，則應(yīng)選擇型膠原酶對(duì)軟骨進(jìn)行消化，否則無法獲取想要的軟骨細(xì)胞或獲取的細(xì)胞數(shù)量極少而無法進(jìn)行下一步試驗(yàn)。提示骨性關(guān)節(jié)炎軟骨病變過程中，作為軟骨主要成分之一的膠原發(fā)生了改變，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中型膠原被型膠原所取代。在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方面，倒置顯微鏡下，正常及骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞接種后呈球形懸浮在培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時(shí)軟

12、骨細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為透明圓盤狀。培養(yǎng)48小時(shí)后大部分軟骨細(xì)胞貼壁，形態(tài)由圓盤狀逐漸向外伸延突起而轉(zhuǎn)化成多角形，少數(shù)呈梭形。隨著軟骨細(xì)胞數(shù)量的增加和體積增大，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，培養(yǎng)10余日后軟骨細(xì)胞逐漸融合成單層，呈“鋪路石”樣外觀。    正常、骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞生長曲線：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論正常還是骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，其細(xì)胞周期均較文獻(xiàn)報(bào)道時(shí)間延長，分析其結(jié)果可能有如下原因：培養(yǎng)細(xì)胞的作用條件不同，也可能是導(dǎo)致細(xì)胞周期不同的誘導(dǎo)因素。就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞細(xì)胞周期較正常軟骨細(xì)胞周期要短，其可能原因：骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞為變性軟骨細(xì)胞，細(xì)胞功能的改變可能影響細(xì)胞周期的變化。郭氏等已通過實(shí)驗(yàn)證明，損傷的骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中，軟骨細(xì)胞代謝活躍，相伴隨的細(xì)胞分泌的各種胞外基質(zhì)也相應(yīng)高表達(dá)，軟骨代謝的異常，導(dǎo)致胞外基質(zhì)成分的異常，軟骨細(xì)胞生存環(huán)境改變促使軟骨細(xì)胞過早的死亡，加劇骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程；骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中混雜有纖維軟骨細(xì)胞，纖維軟骨細(xì)胞增殖速度明顯較軟骨細(xì)胞快，必將影響細(xì)胞周期的變化。   本課題研究兔骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞