聯(lián)合顯微切割及PCR方法對結外NKT細胞淋巴瘤中EB病毒的檢測

1、    聯(lián)合顯微切割及PCR方法對結外NK/T細胞淋巴瘤中EB病毒的檢測            作者：李開智時間：2008-12-29 14:28:00                     摘要：目的：研究結外鼻型NKT細胞淋巴瘤中EB

2、病毒基因的表達。方法：篩選NKT細胞淋巴瘤56例，應用手工顯微切割進行組織純化后，用PCR檢測EBV的基因序列，并同時對相應組織用EBV抗體做免疫組織化學染色檢查，對兩種方法進行了比較。結果：56例NKT細胞淋巴瘤應用手工顯微切割進行組織純化后，用PCR方法EBV陽性率為3956(69.64)，而用免疫組化方法陽性率為756(12.50)，二者檢出率有顯著差異。結論：顯微切割聯(lián)合PCR技術能明顯提高EB病毒檢出率和準確性，是檢測EBV的有效方法。 關鍵詞：鼻NKT細胞淋巴瘤；EB病毒；手工顯微切割；聚合酶鏈反應 中圖分類號：R373.9；R733.4文獻標識碼：A文章編號：10082409(2

3、007)04067803 淋巴瘤是淋巴細胞單克隆增殖性疾病，由于瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展重演了B、T細胞各階段的發(fā)育，其形態(tài)學和遺傳學改變表現(xiàn)出高度的異質性及組成成分的復雜性，成為困擾淋巴瘤診斷的主要原因。PCR檢測淋巴細胞單克隆增殖性疾病失敗的原因之一可能與送檢標本中包含腫瘤細胞的多少，間雜壞死組織和多種炎癥細胞背景有關。根據組織純化的原理，在HE染色或亞甲藍等染色下，用顯微切割的方法直接分離出腫瘤細胞，再聯(lián)合PCR技術，排除了非腫瘤細胞基因組DNA的影響可以提高PCR檢測陽性率和準確性。結外NKT細胞淋巴瘤鼻型是2001年WHO正式命名的新的淋巴瘤亞型，亞洲多發(fā)，在中國特別是南部地區(qū)多發(fā)。本研究

4、應用手工顯微切割(handmade microdissection)及聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術檢測結外NKT細胞淋巴瘤(nasal NKTcell lymphoma，NKTCL)病變中EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)基因的存在情況，并同時對相應組織用EBV抗體做免疫組織化學染色相比較。 1材料與方法 1.1材料來源 收集2001年1月至2006年3月桂林醫(yī)學院及廣西醫(yī)科大學鼻部非霍奇金氏淋巴瘤外檢病例，復習形態(tài)學、免疫組織化學(CD3e、CD45RO、CD20、CD56、GrB、LMP1等)，根據2001年WHO關于

5、淋巴造血組織腫瘤分類結外鼻型NKT細胞淋巴瘤診斷標準篩選，對形態(tài)學較符合但免疫組化不全或不符者重做免疫組化，共選出符合結外NKT細胞淋巴瘤病例56例。選出鼻咽部慢性炎性組織20例做對照。 1.2研究方法 1.2.1 免疫組織化學方法 根據福州邁新生物技術開發(fā)公司推薦的免疫組化EliVisionTMplus法EBV抗體濃度為1:50。 陽性判定標準：以胞膜棕黃色和胞漿點狀棕黃色為EBV陽性。用已知EBV陽性的霍奇金淋巴瘤(HD)作陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。免疫組化陽性判斷標準：腫瘤細胞陽性表達數(shù)10個HP者，均視為陽性病例。陽性信號位于細胞膜，呈棕黃色。 1.2.2顯微切割選取

6、相應石蠟組織，按常規(guī)切取石蠟切片，連續(xù)切片，平鋪于普通未涂膠的載玻片上，厚5m切片經常規(guī)的蘇木精一伊紅(HematineEosine，HE)染色，不加蓋載玻片；用手工操作顯微切割法：用手術刀片和9號注射針頭配合應用，將切片放在顯微鏡載物臺上，找到要切割的細胞，在低倍鏡下，手持刀片在被切割細胞周圍來回刻劃，切挖直至與周圍組織分離；用針頭蘸少量粘合劑，漸漸接近被切割細胞，小心讓其表面粘合劑與被切割細胞接觸，由于二者粘合力較細胞與其下方的載玻片的粘合力大，抽回細針時，其尖端的細胞也隨之被取出來，然后直接將細針連同其上粘附的細胞放入準備好的EP管中，繼續(xù)其后的試驗。 1.2.3 DNA提取和純化將提取

7、物加入新鮮配制的PK緩沖液(10mmolL Tris，HCI，pH8.0；1mmolL EDTA，pH8.0；1SDS)190l+511蛋白酶K(20mgL Protease K，PK)，70水浴1h。追加10l PK(20gl)，置55溫箱過夜。加入等體積酚氯仿異戊醇溶液，混勻，13000rpm離心10min，取上層水相置另一離心管。重復步驟3一次。加入12體積醋酸銨+2.5倍體積無水乙醇，混勻，置20過夜。離心，13000rpm離心10min，倒棄液體。加入75乙醇，混勻，13000rpm離心10min，倒棄液體，晾干。加入50l雙蒸水，溶解20min，置20保存。核酸測定儀上測定DNA濃

8、度及吸光度比值，A260A280比值在1.60以下者棄用。 1.2.4 PCR 參考文獻選取EBV特異性基因片段作為引物檢測組織中EBV的表達，引物在基因庫中經BLAST核對無誤。EBV上游引物：5'-ACAATGCCTGTCCGTGCAAA-3'，EBV下游引物：5'-CTTCAGAAGAGACCTTCTCT-3'，片段大小為181bp。PCR反應條件：94 50s，5350s，721min，Thermal Cycler480DNA熱循環(huán)儀上進行循環(huán)32次，72延伸10min。PCR反應體系為25l，其中10×PCR buffer 2.5l、2.5m

9、molL dNTP 2l、25mmolL MgCl2 1.5l、引物(10mmolL)各1l，DNA聚合酶0.2U，模板DNA 5l，以ddH2O補足體積。采用Takara公司Taq酶。2瓊脂糖凝膠電泳，goldview染色，凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果并照相。條帶為181bp左右。對照設置：以已知EBV陽性的鼻咽癌組織為陽性對照，已知陰性的鼻咽部炎性組織為陰性對照，dd H2O替代模板作空白對照。 1.3統(tǒng)計學方法 以SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行四格表資料的x。檢驗，以P<0.05判為差異有顯著意義。 2結果 2.1 PCR檢測結果 56例中用PCR方法檢測39例陽性(69.64)，與鼻咽部

10、慢性炎組織(220)相比有顯著差異(見表1)。 2.2免疫組化檢測結果 56例中用免疫組化檢測EBV陽性者7例(12.5)，與鼻咽部慢性炎組織(O20)相比無顯著差異(見表2)。 2.3 EBV兩種檢測方法比較 應用PCR方法與免疫組化方法相比較，結果有顯著差異(見表3)。 3討論 EBV檢測有助于淋巴瘤增殖的不同診斷，探知治療后疾病的殘余和早期復發(fā)。PCR能利用新鮮組織，冷凍或石蠟組織，能檢測已知的染色體異位，應用范圍廣泛。但是EBV在免疫組化中表達文獻報道常不一致(經常陰性或可變的)，如VanGorp J報道結外鼻型NKT細胞淋巴瘤EBV免疫組化檢測陽性率為420(20)，李百周、劉衛(wèi)平以

11、及萬榕用免疫組化檢測EBV陽性率分別為16.7(212)、26.3(519)、50(1020)。免疫組化中表達如此不一致，給病理診斷帶來了嚴重干擾和困惑，不利于診斷的提高。趙莎等從蛋白和DNA水平上檢測了67例結外鼻型NKT細胞淋巴瘤EBV的表達情況，并觀察到EBV-DNA檢出率明顯高于蛋白的檢出率，本試驗與其基本相符。表達不一致的原因，可能由于腫瘤細胞在不同分化成熟階段EBV蛋白表達水平不同，也可能由于EBV的轉錄和翻譯水平受其它許多因素的影響，還可能與組織經過福爾馬林處理、抗原修復困難等技術原因以及所選用抗體不同有關。因為免疫組化對EBV的檢出率偏低，所以對于診斷沒有很大的意義。而PCR方

12、法能有效提高EBV的檢出率和準確性，還可進一步進行基因分析和研究。如中國臺灣地區(qū)研究22例鼻型NKT細胞淋巴瘤，發(fā)現(xiàn)有14例表達LMP-1，并且表現(xiàn)為缺失30bp的基因型，認為基因缺失型LMP-1的高表達與臺灣地區(qū)EBV相關的鼻型NKT細胞淋巴瘤發(fā)病率較高有關。 我國人群中特別在南方地區(qū)EB病毒的感染率較高。目前研究認為鼻部NKT細胞淋巴瘤EBV感染率很高，高達90以上。LMP-1在離體實驗中有細胞轉換潛能，具有腫瘤基因產物的特征，誘導基因失調和形態(tài)學改變；誘導BCL一2基因產物的表達，阻止程序性細胞死亡，從而促進EB病毒感染細胞的永生化。研究發(fā)現(xiàn)LMP-1可使嚙齒類動物的成纖維細胞轉化并在裸

13、鼠中成瘤，也可以引起一系列的細胞粘附因子(如ICAM-1、LFAl及LFA3等)和表皮生長因子受體(EpidermalGrowth Factor Receptor，EGFR)改變，有助于細胞的生長轉化與轉移浸潤。LMP-1還可抑制細胞凋亡，主要與NF-kB通路，MAPK通路和JAKsTAT通路等凋亡信號傳導系統(tǒng)相關。因此，LMP-1是EB病毒致瘤的一個關鍵步驟。LMP-1在結外NKT淋巴瘤中的表達證明EB病毒基因組可被轉錄和翻譯為蛋白質，說明腫瘤細胞內的EB病毒不是一個“沉默的”過路者，而是致病的重要因素，LMP-1對該淋巴瘤的形成和發(fā)展起著重要的作用。盡管目前國內外報道在淋巴瘤病變中檢出EB病毒DNA，提示EB病毒可能與淋巴瘤的發(fā)生有關，但由于陽性結果僅能說明細胞中有EB病毒DNA的整合，至于EB病毒在這些病變中究竟發(fā)揮什么作用，還有待于進一步研究。EB病毒感染在鼻NKT細胞淋巴瘤發(fā)生及發(fā)展中的確切