激光掃描共聚焦顯微鏡

1、 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù) Laser scanning confocal microscopy 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點: 1.點照明,具有照明pinhole和探測pinhole 2.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦), 共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面 3.具有掃描系統(tǒng) 逐點掃描成像 4. 激光作為光源 5.具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個被標記物 Fluorescent MicroscopeObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOc

2、ularExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal Microscope人眼分辨率：0.2mm光學顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm 電子顯微鏡的缺點電子顯微鏡的缺點：1.由于樣品需要固定由于樣品需要固定,觀測活細胞十分困難觀測活細胞十分困難.2.樣品制備過程（固定、包埋、切片）造成的假象樣品制備過程（固定、包埋、切片）造成的假象 熒光顯微鏡的缺點熒光顯微鏡的缺點:1.無法實現(xiàn)對熒光無法實現(xiàn)對

3、熒光,透射光的同時采集透射光的同時采集,無法實現(xiàn)多熒光的無法實現(xiàn)多熒光的同時采集同時采集2.熒光散射光太強，造成實際分辨率的大大下降。熒光散射光太強，造成實際分辨率的大大下降。3.熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。4.無法對樣品進行斷層掃描無法對樣品進行斷層掃描,完成完成3D的工作的工作.5.對于信號較弱的樣本對于信號較弱的樣本,無法提高觀察的靈敏度無法提高觀察的靈敏度.6.可以觀查活細胞或組織但細胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊可以觀查活細胞或組織但細胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊激光共聚焦顯微鏡的應用激光共聚焦顯微鏡的應用 單、雙、三單、雙、三, ,四色標記檢測。四

4、色標記檢測。 精確的一、二、三、四維觀察。精確的一、二、三、四維觀察。 高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。反射成像。 靜態(tài)和動態(tài)觀察靜態(tài)和動態(tài)觀察( (CACA2+2+,pH,pH,膜電位膜電位, ,膜流動膜流動性等性等) )。 定性以及定量分析。定性以及定量分析。 光譜掃描光譜掃描, ,ROIROI掃描掃描. . 特殊的光反應特殊的光反應( (FREP,FRAP,CAGED-UNCAGEDFREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等等) )。時間分辨和快速掃描動態(tài)圖像出色的反射光圖像明場，DIC, 相差和透射光圖像 單標，雙標和三標圖像 激

5、光共聚焦顯微成像技術(shù)的應用激光共聚焦顯微成像技術(shù)的應用 一一.定位、定量定位、定量免疫熒光標記（單標、雙標或三免疫熒光標記（單標、雙標或三 標）的定位、定量標）的定位、定量 如：細胞膜受體或抗原的分布，如：細胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管的分布、微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的兩種或三種蛋白的共存共存與與 共定位共定位、蛋白與細胞器的共定位、干細胞的分化、蛋白與細胞器的共定位、干細胞的分化細胞凋亡細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交末端原位雜交-fitc + PI熒光原位雜交：熒光原位雜交： 染色體基因定位染色體基因定位單細胞凝膠電泳單細胞凝膠電泳GFP的表達

6、的表達活細胞或活體組織靜息游離活細胞或活體組織靜息游離Ca2+ 的分布與定量的分布與定量活細胞內(nèi)活細胞內(nèi)pH的定量、膜電位的測量的定量、膜電位的測量活細胞內(nèi)自由基水平的定量活細胞內(nèi)自由基水平的定量 Helagreen-中心體中心體red- 紡錘體紡錘體 Immuno-fluorecence label 二二. .光學切片和三維重組光學切片和三維重組 光學切片和三維重組:LSCM通過薄層光學切片功能，可獲得標本真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機圖像處理及三維重建軟件，產(chǎn)生生動逼真的三維效果，可進行形態(tài)學觀察，并揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系，用以闡明三維結(jié)構(gòu)與組織功能之間的關(guān)系。顯微顯微CT與三維重組與三

7、維重組 3D reconstruction 三三.動態(tài)測量動態(tài)測量游離游離Ca2+, Mg2+、K+、Na+測量測量pH值的檢測值的檢測 自由基的檢測自由基的檢測相對相對 測量測量程序化測量程序化測量：用：用timelapse中的中的編程編程按鈕按鈕可可進行不同時間進行不同時間序列序列的掃描的掃描測量測量 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Physiology Chart (Time: 11:40:49)0.0040.0080.00120.00160.00Int.200.00400.00600.00800.001000.001200.00sChannel 1Channel 20

8、.0020.0040.0060.0080.00Int.200.00400.00600.00800.001000.001200.00s四四. .細胞膜電位的測量細胞膜電位的測量標記膜電位探針標記膜電位探針( (慢反應）：慢反應）：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3) 548nm 573nmDioc6(3) 484nm 500nm快反應探針：快反應探針：Di-4-ANEPPS 496nm 703nmDi-4-ANEPPS 498nm 713nm細胞膜靜息膜電位：細胞膜靜息膜電位：-70mV線粒體膜電位：線粒體膜電位：-150mV以上均屬于陽離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜

9、電位探針以上均屬于陽離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針 FRAP( Fluorescence recovery after FRAP( Fluorescence recovery after photobleachingphotobleaching) )原理原理Intense laser BeamBleaches FluorescenceRecovery of fluorescence10 seconds30 secondsZero timeTime%F五五. .熒光漂白恢復熒光漂白恢復( (FRAP: Fluorescence Recover after photobleach

10、ing）熒光光漂白后的回復：熒光光漂白后的回復：FRAPFRAP 生物膜脂質(zhì)分子的側(cè)向擴散；生物膜脂質(zhì)分子的側(cè)向擴散； 胞間通訊的研究；胞間通訊的研究； 胞漿及細胞器內(nèi)小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移性的觀測等胞漿及細胞器內(nèi)小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移性的觀測等 細胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)及大分子組裝等。細胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)及大分子組裝等。六熒光能量共振轉(zhuǎn)移六熒光能量共振轉(zhuǎn)移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能或能量從一個分子向另一個

11、分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件兩個熒光分子：供體兩個熒光分子：供體-FL1，受體受體-FL2供體與受體的距離在供體與受體的距離在2-7nm供體供體的的發(fā)射波長發(fā)射波長與與受體受體的的激發(fā)波長激發(fā)波長一致一致熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù) 生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究 免疫分析 核酸雜交分析 蛋白質(zhì)間相互作用研究r: 分子間距離分子間距離 R0: 分子間分子間發(fā)生發(fā)生50%能量轉(zhuǎn)移的距離能量轉(zhuǎn)移的距離 DAr 2R0Dr 2R0Al檢測檢測 以FL1的激發(fā)波長的光照射樣品，沒有共振轉(zhuǎn)移時，只檢

12、測到 FL1的發(fā)射光(綠光)，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時，就可檢測出 FL1的熒光(綠光)減弱，F(xiàn)L2(紅光)的增強。l應用：檢測大分子的相互作用應用：檢測大分子的相互作用 大分子構(gòu)象的改變(蛋白) 例：大分子(亞基)的結(jié)合與分離 受體與配體的結(jié)合 常用熒光探劑：常用熒光探劑：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP 曲霉營養(yǎng)菌絲橫隔不同霉菌自發(fā)熒光成像，示普通光學顯微鏡下不曾觀察到的現(xiàn)象微生物自發(fā)熒光微生物自發(fā)熒光ConfocalConfocal成像成像植物學應用植物學應用:植物細胞中的微管列陣植物細胞中的微管列陣(microtubule array)周質(zhì)微管早前期微管帶紡錘體成膜體農(nóng)業(yè)

13、的應用農(nóng)業(yè)的應用:植物細胞中的微絲分布植物細胞中的微絲分布 煙草懸浮培養(yǎng)細胞中的微絲網(wǎng)絡煙草懸浮培養(yǎng)細胞中的微絲網(wǎng)絡農(nóng)業(yè)的應用農(nóng)業(yè)的應用:花粉萌發(fā)過程中微絲骨架的變化花粉萌發(fā)過程中微絲骨架的變化農(nóng)業(yè)的應用農(nóng)業(yè)的應用:Jasplakinolide解聚微絲的實時觀察解聚微絲的實時觀察Zaslavskaia et.al, Martek Biosciences, MD, June 15, 2001November 2001; Volume 128 (21): pp 4301-4314. Courtesy: Jose-Eduardo Gomes, University of Oregon, USANat

14、ure, 25 April 2002, pg 854 GFP-MAP4融合蛋白表達顯示微管融合蛋白表達顯示微管骨架（美國骨架（美國Cyr實驗室）實驗室）奶山羊發(fā)育中乳腺上皮細胞主要細胞器的變化 為研究奶山羊乳腺的胚后形態(tài)發(fā)育，采用活細胞熒光標記法結(jié)合激光共聚焦顯微技術(shù)，觀察奶山羊乳腺發(fā)育中主要細胞器的變化。根據(jù)奶山羊乳腺發(fā)育特點，采樣時點分為：妊娠期 1 月、3 月、5 月； 泌乳期 10 日、30、60 日、120 日；退化期 3 日、7 日、21 日，共計 10 個時點。 主要試劑及耗材主要試劑及耗材 DMSO 購自 Sigma 公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS） 、DF12 培養(yǎng)基、I型膠原酶

15、均購自 Gibco公司；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針（E-34251，激發(fā)/發(fā)射波長為 504/511nm） 、線粒體熒光探針（M-7512，激發(fā)/發(fā)射波長為 579/599nm） 、Hochest 33258 均購自 Invitrogen公司。Confocal 專用細胞培養(yǎng)皿購自北京博蕾德科技公司。 奶山羊乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng) 無菌切取 13g 乳腺組織，膠原酶消化法進行乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)。對膠原酶濃度及消化時間進行優(yōu)化，確定最適酶濃度為 400U/ml，消化時間為 3.5 小時。以 1x106個/ml的密度鋪于 Confocal 專用細胞培養(yǎng)皿中，置于 5CO2、37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察細胞生長情況。23 天更換培養(yǎng)液，觀察細胞生長約 8090匯合度時，進行細胞器熒光檢測。 乳腺上皮細胞主要細胞器的檢測乳腺上皮細胞主要細胞器的檢測 37預熱、 終濃度為50nmol/L的M-7512工作液，37染色40min；37預熱、終濃度為 1mol/L 的 E-34251 工作液，37染色 30min