激光掃描共聚焦顯微鏡

1、 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù) Laser scanning confocal microscopy 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn): 1.點(diǎn)照明,具有照明pinhole和探測(cè)pinhole 2.照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛(共焦), 共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面 3.具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像 4. 激光作為光源 5.具有多個(gè)（四個(gè)） 熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物 Fluorescent MicroscopeObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOc

2、ularExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal Microscope人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm 電子顯微鏡的缺點(diǎn)電子顯微鏡的缺點(diǎn)：1.由于樣品需要固定由于樣品需要固定,觀測(cè)活細(xì)胞十分困難觀測(cè)活細(xì)胞十分困難.2.樣品制備過(guò)程（固定、包埋、切片）造成的假象樣品制備過(guò)程（固定、包埋、切片）造成的假象 熒光顯微鏡的缺點(diǎn)熒光顯微鏡的缺點(diǎn):1.無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)

3、熒光,透射光的同時(shí)采集透射光的同時(shí)采集,無(wú)法實(shí)現(xiàn)多熒光的無(wú)法實(shí)現(xiàn)多熒光的同時(shí)采集同時(shí)采集2.熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3.熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。4.無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描,完成完成3D的工作的工作.5.對(duì)于信號(hào)較弱的樣本對(duì)于信號(hào)較弱的樣本,無(wú)法提高觀察的靈敏度無(wú)法提高觀察的靈敏度.6.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用 單、雙、三單、雙、三, ,四色標(biāo)記檢測(cè)。四

4、色標(biāo)記檢測(cè)。 精確的一、二、三、四維觀察。精確的一、二、三、四維觀察。 高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。反射成像。 靜態(tài)和動(dòng)態(tài)觀察靜態(tài)和動(dòng)態(tài)觀察( (CACA2+2+,pH,pH,膜電位膜電位, ,膜流動(dòng)膜流動(dòng)性等性等) )。 定性以及定量分析。定性以及定量分析。 光譜掃描光譜掃描, ,ROIROI掃描掃描. . 特殊的光反應(yīng)特殊的光反應(yīng)( (FREP,FRAP,CAGED-UNCAGEDFREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等等) )。時(shí)間分辨和快速掃描動(dòng)態(tài)圖像出色的反射光圖像明場(chǎng)，DIC, 相差和透射光圖像 單標(biāo)，雙標(biāo)和三標(biāo)圖像 激

5、光共聚焦顯微成像技術(shù)的應(yīng)用激光共聚焦顯微成像技術(shù)的應(yīng)用 一一.定位、定量定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo)）的定位、定量標(biāo)）的定位、定量 如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管的分布、微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的兩種或三種蛋白的共存共存與與 共定位共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位、干細(xì)胞的分化、蛋白與細(xì)胞器的共定位、干細(xì)胞的分化細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交末端原位雜交-fitc + PI熒光原位雜交：熒光原位雜交： 染色體基因定位染色體基因定位單細(xì)胞凝膠電泳單細(xì)胞凝膠電泳GFP的表達(dá)

6、的表達(dá)活細(xì)胞或活體組織靜息游離活細(xì)胞或活體組織靜息游離Ca2+ 的分布與定量的分布與定量活細(xì)胞內(nèi)活細(xì)胞內(nèi)pH的定量、膜電位的測(cè)量的定量、膜電位的測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)自由基水平的定量活細(xì)胞內(nèi)自由基水平的定量 Helagreen-中心體中心體red- 紡錘體紡錘體 Immuno-fluorecence label 二二. .光學(xué)切片和三維重組光學(xué)切片和三維重組 光學(xué)切片和三維重組:LSCM通過(guò)薄層光學(xué)切片功能，可獲得標(biāo)本真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件，產(chǎn)生生動(dòng)逼真的三維效果，可進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系，用以闡明三維結(jié)構(gòu)與組織功能之間的關(guān)系。顯微顯微CT與三維重組與三

7、維重組 3D reconstruction 三三.動(dòng)態(tài)測(cè)量動(dòng)態(tài)測(cè)量游離游離Ca2+, Mg2+、K+、Na+測(cè)量測(cè)量pH值的檢測(cè)值的檢測(cè) 自由基的檢測(cè)自由基的檢測(cè)相對(duì)相對(duì) 測(cè)量測(cè)量程序化測(cè)量程序化測(cè)量：用：用timelapse中的中的編程編程按鈕按鈕可可進(jìn)行不同時(shí)間進(jìn)行不同時(shí)間序列序列的掃描的掃描測(cè)量測(cè)量 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Physiology Chart (Time: 11:40:49)0.0040.0080.00120.00160.00Int.200.00400.00600.00800.001000.001200.00sChannel 1Channel 20

8、.0020.0040.0060.0080.00Int.200.00400.00600.00800.001000.001200.00s四四. .細(xì)胞膜電位的測(cè)量細(xì)胞膜電位的測(cè)量標(biāo)記膜電位探針標(biāo)記膜電位探針( (慢反應(yīng)）：慢反應(yīng)）：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3) 548nm 573nmDioc6(3) 484nm 500nm快反應(yīng)探針：快反應(yīng)探針：Di-4-ANEPPS 496nm 703nmDi-4-ANEPPS 498nm 713nm細(xì)胞膜靜息膜電位：細(xì)胞膜靜息膜電位：-70mV線粒體膜電位：線粒體膜電位：-150mV以上均屬于陽(yáng)離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜

9、電位探針以上均屬于陽(yáng)離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針 FRAP( Fluorescence recovery after FRAP( Fluorescence recovery after photobleachingphotobleaching) )原理原理Intense laser BeamBleaches FluorescenceRecovery of fluorescence10 seconds30 secondsZero timeTime%F五五. .熒光漂白恢復(fù)熒光漂白恢復(fù)( (FRAP: Fluorescence Recover after photobleach

10、ing）熒光光漂白后的回復(fù)：熒光光漂白后的回復(fù)：FRAPFRAP 生物膜脂質(zhì)分子的側(cè)向擴(kuò)散；生物膜脂質(zhì)分子的側(cè)向擴(kuò)散； 胞間通訊的研究；胞間通訊的研究； 胞漿及細(xì)胞器內(nèi)小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移性的觀測(cè)等胞漿及細(xì)胞器內(nèi)小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移性的觀測(cè)等 細(xì)胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)及大分子組裝等。細(xì)胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)及大分子組裝等。六熒光能量共振轉(zhuǎn)移六熒光能量共振轉(zhuǎn)移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。能量的提供者叫能或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)

11、分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件兩個(gè)熒光分子：供體兩個(gè)熒光分子：供體-FL1，受體受體-FL2供體與受體的距離在供體與受體的距離在2-7nm供體供體的的發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)與與受體受體的的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)一致一致熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù) 生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究 免疫分析 核酸雜交分析 蛋白質(zhì)間相互作用研究r: 分子間距離分子間距離 R0: 分子間分子間發(fā)生發(fā)生50%能量轉(zhuǎn)移的距離能量轉(zhuǎn)移的距離 DAr 2R0Dr 2R0Al檢測(cè)檢測(cè) 以FL1的激發(fā)波長(zhǎng)的光照射樣品，沒(méi)有共振轉(zhuǎn)移時(shí)，只檢

12、測(cè)到 FL1的發(fā)射光(綠光)，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時(shí)，就可檢測(cè)出 FL1的熒光(綠光)減弱，F(xiàn)L2(紅光)的增強(qiáng)。l應(yīng)用：檢測(cè)大分子的相互作用應(yīng)用：檢測(cè)大分子的相互作用 大分子構(gòu)象的改變(蛋白) 例：大分子(亞基)的結(jié)合與分離 受體與配體的結(jié)合 常用熒光探劑：常用熒光探劑：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP 曲霉?fàn)I養(yǎng)菌絲橫隔不同霉菌自發(fā)熒光成像，示普通光學(xué)顯微鏡下不曾觀察到的現(xiàn)象微生物自發(fā)熒光微生物自發(fā)熒光ConfocalConfocal成像成像植物學(xué)應(yīng)用植物學(xué)應(yīng)用:植物細(xì)胞中的微管列陣植物細(xì)胞中的微管列陣(microtubule array)周質(zhì)微管早前期微管帶紡錘體成膜體農(nóng)業(yè)

13、的應(yīng)用農(nóng)業(yè)的應(yīng)用:植物細(xì)胞中的微絲分布植物細(xì)胞中的微絲分布 煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的微絲網(wǎng)絡(luò)煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的微絲網(wǎng)絡(luò)農(nóng)業(yè)的應(yīng)用農(nóng)業(yè)的應(yīng)用:花粉萌發(fā)過(guò)程中微絲骨架的變化花粉萌發(fā)過(guò)程中微絲骨架的變化農(nóng)業(yè)的應(yīng)用農(nóng)業(yè)的應(yīng)用:Jasplakinolide解聚微絲的實(shí)時(shí)觀察解聚微絲的實(shí)時(shí)觀察Zaslavskaia et.al, Martek Biosciences, MD, June 15, 2001November 2001; Volume 128 (21): pp 4301-4314. Courtesy: Jose-Eduardo Gomes, University of Oregon, USANat

14、ure, 25 April 2002, pg 854 GFP-MAP4融合蛋白表達(dá)顯示微管融合蛋白表達(dá)顯示微管骨架（美國(guó)骨架（美國(guó)Cyr實(shí)驗(yàn)室）實(shí)驗(yàn)室）奶山羊發(fā)育中乳腺上皮細(xì)胞主要細(xì)胞器的變化 為研究奶山羊乳腺的胚后形態(tài)發(fā)育，采用活細(xì)胞熒光標(biāo)記法結(jié)合激光共聚焦顯微技術(shù)，觀察奶山羊乳腺發(fā)育中主要細(xì)胞器的變化。根據(jù)奶山羊乳腺發(fā)育特點(diǎn)，采樣時(shí)點(diǎn)分為：妊娠期 1 月、3 月、5 月； 泌乳期 10 日、30、60 日、120 日；退化期 3 日、7 日、21 日，共計(jì) 10 個(gè)時(shí)點(diǎn)。 主要試劑及耗材主要試劑及耗材 DMSO 購(gòu)自 Sigma 公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS） 、DF12 培養(yǎng)基、I型膠原酶

15、均購(gòu)自 Gibco公司；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針（E-34251，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為 504/511nm） 、線粒體熒光探針（M-7512，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為 579/599nm） 、Hochest 33258 均購(gòu)自 Invitrogen公司。Confocal 專用細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自北京博蕾德科技公司。 奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 無(wú)菌切取 13g 乳腺組織，膠原酶消化法進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。對(duì)膠原酶濃度及消化時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，確定最適酶濃度為 400U/ml，消化時(shí)間為 3.5 小時(shí)。以 1x106個(gè)/ml的密度鋪于 Confocal 專用細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于 5CO2、37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。23 天更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)約 8090匯合度時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞器熒光檢測(cè)。 乳腺上皮細(xì)胞主要細(xì)胞器的檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞主要細(xì)胞器的檢測(cè) 37預(yù)熱、 終濃度為50nmol/L的M-7512工作液，37染色40min；37預(yù)熱、終濃度為 1mol/L 的 E-34251 工作液，37染色 30min