知識(shí)點(diǎn)5核酸的性質(zhì)

1、4.5 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)一、解離性質(zhì) 多聚核苷酸有兩類(lèi)可解離的基團(tuán)：磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。 磷酸是中等強(qiáng)度的酸，堿基的堿性較弱，因此，核酸等電點(diǎn)在較低的 pH 范圍內(nèi)。DNA 等電點(diǎn) 44.5RNA 等電點(diǎn) 2 2.5RNA 鏈中，核糖 C'2-OH 的氫能與磷酸酯中的羥基氧形成氫鏈，促進(jìn)磷酸酯羥基氫原子的 解離。二、水解性質(zhì)1、堿水解室溫， 0.1mol/LNaOH 可將 RNA 完全水解，得到 2'-或 3'-磷酸核苷的混合物。在相同條件下， DNA 不被水解。 這是因?yàn)?RNA 中 C'2-OH 的存在， 促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。DNA 、RNA 水

2、解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。DNA 穩(wěn)定 ，遺傳信息。RNA 是 DNA 的信使，完成任務(wù)后降解。2、酶水解 生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶RNA 水解酶 RNaseDNA 水解酶 DNase核酸外一切酶核酸內(nèi)切酶 最重要的：限制性核酸內(nèi)切酶三、光吸收性堿基具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在 240290nm 的紫外波段有強(qiáng)烈的光吸 收，入 max=260nm1、鑒定純度純 DNA 的 A260/A280 應(yīng)為 1.8（1.65-1.85 ），若大于 1.8，表示污染了 RNA 。純 RNA 的 A260/A280 應(yīng)為 2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則 A260/A280

3、 比值明顯降低。2、含量計(jì)算1 ABS 值相當(dāng)于： 50ug/mL 雙螺旋 DNA或： 40ug/mL 單螺旋 DNA （或 RNA ）或： 20ug/mL 核苷酸3、增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)：在 DNA 的變性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)增大 減色效應(yīng)：在 DNA 的復(fù)性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)減小。四、沉降特性（ DNA ）不同構(gòu)象的核酸（線(xiàn)形、環(huán)形、超螺旋） ，起密度和沉降速率不同，用 Cs-Cl 密度梯度離心 就可以將它們區(qū)分開(kāi)來(lái)，這一方法常用于質(zhì)粒 DNA 的純化。相對(duì)沉降常數(shù)線(xiàn)型雙螺旋分子1.00松馳雙鏈閉環(huán)1.14切刻雙鏈環(huán)1.14單鏈環(huán)1.14線(xiàn)型單鏈1.30正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀1.4

4、1坍縮3.0五、變性、復(fù)性及雜交變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對(duì)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，核酸可以耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。這也是核酸研究技術(shù)的基礎(chǔ)。1、變性（1）變性：核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。 多核苷酸骨架上共價(jià)鍵的斷裂稱(chēng)核酸的降解。DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。熱變性因素"酸堿變性（pH小于4或大于11,堿基間氫鍵全部斷裂）I 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）變性后：粘度降低、浮力密度升高、260nm光吸收值增加、二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活（2）熔解溫度（Tm ）或稱(chēng)熔點(diǎn)：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度。DNA的Tm 一般在70

5、85C之間。濃度50ug/mL時(shí)，雙鏈 DNA A260=1.00，完全變性（單鏈） A260= 1.37當(dāng)A260增加到最 大增大值一半時(shí)，即 1.185時(shí)，對(duì)應(yīng)的溫度即為 Tm。（3）影響DNA的Tm值的因素 DNA均一性均一性高，熔解過(guò)程發(fā)生在很小的溫度范圍內(nèi)。 G-C含量與Tm值成正比，G-C含量高，則Tm越高，測(cè)定Tm ,可推知G-C含量。G-C%= （Tm-69.3） X2.44 介質(zhì)中離子強(qiáng)度其它條件不變，離子強(qiáng)度高，Tm高。2、復(fù)性變性DNA在適當(dāng)（一般低于 Tm20 25 C）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。變性DNA在緩慢冷卻時(shí)（快速冷卻可防止復(fù)性），可以復(fù)性。DNA片

6、段越大，復(fù)性越慢；DNA濃度越大，復(fù)性越快。復(fù)性速度可用Co 衡量。Co為變性DNA原始濃度mol L-1 , t為時(shí)間，以秒表示。3、雜交（DNA DNA、DNA RNA ）將不同來(lái)源的 DNA混合加熱，變性后，慢慢冷卻使它復(fù)性。若這些異源DNA之間，在某些區(qū)域有相同的序列，則復(fù)性時(shí)會(huì)形成雜交分子。4、分子雜交、Southern BlottingSouthern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位?？捎肈NA或RNA探針。、Northern Blotting研究對(duì)象是mRNA檢測(cè)可與探針DNA同源雜交的mRNA分子的存在，因而可以研究細(xì)胞內(nèi)特定mRNA的產(chǎn)生, 即特定基因的表達(dá)。mRNA易形成局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，總 RNA或mRNA需在變性條件下電泳，乙二醛、甲醛 可防止RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。、 Western Blotting 是研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、